Identifying gene targets for the metabolic engineering of lycopene biosynthesis in Escherichia coli
- 作者
- Hal Alper, Yong-Su Jin, J.F. Moxley, G. Stephanopoulos
- 单位
- Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology
- 杂志
- Metabolic Engineering（2005）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2004.12.003
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何系统性地识别能够有效提高大肠杆菌番茄红素产量的基因敲除靶点，避免随机/组合搜索的低效。
研究策略
基于全基因组通量平衡分析（FBA）并结合最小代谢调整（MOMA），模拟单基因和多基因敲除对番茄红素产量与生长的影响；通过顺序搜索路径选择靶点，并在工程化大肠杆菌中构建相应敲除突变体进行实验验证。
研究路线图
核心内容
本研究以大肠杆菌为底盘，构建了过量表达dxs、idi、ispF、ispD及crtE、crtB、crtI等番茄红素合成关键基因的工程菌株，并基于全基因组通量平衡分析（FBA）结合最小代谢调整（MOMA）模拟单基因和多基因敲除对产物产量与细胞生长的影响。通过顺序搜索路径系统筛选候选敲除靶点，并构建相应突变体进行实验验证。结果显示，亲本菌株番茄红素产量为4700 ppm（mg/g DCW），单敲除gdhA、gpmB、aceE分别使产量提高13%、7%和9%，双敲除gdhA/gpmB提高18%，而三基因敲除gdhA/aceE/fdhF使产量达到6600 ppm，较亲本提高37%。穷举双敲除模拟还表明，98.6%的高产双敲除组合至少包含一个单敲除高产基因，顺序搜索可有效覆盖最高产表型。该研究将计算模拟与实验验证相结合，证明基于FBA/MOMA的顺序化基因敲除搜索能够高效识别代谢工程靶点，为复杂代谢网络的系统优化提供了实用策略。
创新点
将全基因组通量平衡分析用于番茄红素生产菌株的靶点发现；系统对比顺序搜索与穷举双敲除搜索；实验验证了多个预测的敲除靶点，获得了产量显著提高的多基因敲除菌株。
研究对象（17）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 非甲羟戊酸途径/番茄红素生物合成 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶 (DXS) | 催化 | 染色体过表达靶点，增强前体供给 |
| Escherichia coli | 非甲羟戊酸途径/番茄红素生物合成 | idi | 异戊烯基焦磷酸异构酶 (IDI) | 催化 | 染色体过表达靶点 |
| Escherichia coli | 非甲羟戊酸途径/番茄红素生物合成 | ispF | 2-C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸合酶 (IspF) | 催化 | 染色体过表达靶点（ispFD操纵子） |
| Escherichia coli | 非甲羟戊酸途径/番茄红素生物合成 | ispD | 4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶 (IspD) | 催化 | 染色体过表达靶点（ispFD操纵子） |
| Escherichia coli | 非甲羟戊酸途径/番茄红素生物合成 | crtE | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 (CrtE) | 催化 | 由pAC-LYC质粒异源表达 |
| Escherichia coli | 非甲羟戊酸途径/番茄红素生物合成 | crtB | 八氢番茄红素合酶 (CrtB) | 催化 | 由pAC-LYC质粒异源表达 |
| Escherichia coli | 非甲羟戊酸途径/番茄红素生物合成 | crtI | 八氢番茄红素脱饱和酶 (CrtI) | 催化 | 由pAC-LYC质粒异源表达 |
| Escherichia coli | 谷氨酸代谢/NADPH供应 | gdhA | 谷氨酸脱氢酶 (GdhA) | 催化 | 敲除靶点，敲除后增加NADPH可用性，提高番茄红素产量 |
| Escherichia coli | 糖酵解 | gpmA | 磷酸甘油酸变位酶A (GpmA) | 催化 | 敲除靶点，单敲除实验降低产量，但与gdhA组合双敲除增产 |
| Escherichia coli | 糖酵解 | gpmB | 磷酸甘油酸变位酶B (GpmB) | 催化 | 敲除靶点，单敲除提高产量7%，双敲除gdhA/gpmB提高18% |
| Escherichia coli | 丙酮酸代谢 | aceE | 丙酮酸脱氢酶E1组分 (AceE) | 催化 | 敲除靶点，单敲除增产9%，三敲除gdhA/aceE/fdhF增产37% |
| Escherichia coli | 混合酸发酵/甲酸代谢 | fdhF | 甲酸脱氢酶H (FdhF) | 催化 | 敲除靶点，单敲除增产4%，但在gdhA/aceE背景下为三敲除关键靶点 |
| Escherichia coli | 磷酸戊糖途径 | talB | 转醛醇酶B (TalB) | 催化 | 敲除靶点，在gdhA/aceE背景下有效，但在gdhA背景下不利 |
| Escherichia coli | 磷酸烯醇式丙酮酸羧化途径 | ppc | 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (Ppc) | 催化 | 模拟靶点，但在葡萄糖基础培养基中不可行；补充酪蛋白氨基酸时增产 |
| Escherichia coli | 糖酵解 | eno | 烯醇化酶 (Eno) | 催化 | 单敲除模拟候选，但未进行实验验证 |
| Escherichia coli | 氨基酸代谢/一碳代谢 | glyA | 丝氨酸羟甲基转移酶 (GlyA) | 催化 | 单敲除模拟候选，因预测提升极低被排除 |
| Escherichia coli | 氧化磷酸化 | cyoA | 细胞色素氧化酶bo3亚基I (CyoA) | 能量供给 | 单敲除模拟候选，因底物利用范围受限被排除 |
关键发现
- 亲本工程菌株番茄红素产量为4700 ppm（mg/g DCW）
- 单基因敲除gdhA、gpmB、aceE分别使产量提高13%（±4）、7%（±2）、9%（±4）
- 双敲除gdhA/gpmB提高18%（±3）
- 三基因敲除gdhA/aceE/fdhF使产量达到6600 ppm，较亲本提高37%（±3），摘要中称为近40%
- 穷举双敲除模拟表明，98.6%的高产双敲除组合至少包含一个单敲除高产基因，顺序搜索可覆盖最高产表型。
研究结论
基于FBA/MOMA的顺序化基因敲除搜索能够有效识别代谢工程靶点，所构建的三基因敲除菌株显著提高了番茄红素产量，验证了该方法在复杂代谢网络优化中的实用性。