Expression profiling of genes involved in paclitaxel biosynthesis for targeted metabolic engineering
- 作者
- Ezekiel Nims, Camille P. Dubois, Susan C. Roberts, Elsbeth L. Walker
- 单位
- Plant Biology Graduate Program, University of Massachusetts; Department of Chemical Engineering, University of Massachusetts; Department of Biology, University of Massachusetts
- 杂志
- Metabolic Engineering（2006）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2006.04.001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析Taxus cuspidata悬浮细胞中紫杉醇生物合成途径的调控机制，识别限速步骤，为靶向代谢工程提高紫杉醇产量提供依据
研究策略
利用100 μM茉莉酸甲酯(MJ)诱导P991红豆杉悬浮细胞，通过RNA凝胶印迹和半定量RT-PCR分析11个已知途径基因的表达时程，并通过HPLC定量紫杉烷代谢物，将基因表达水平与代谢物积累关联
核心内容
该研究以Taxus cuspidata P991悬浮细胞为对象，利用100 μM茉莉酸甲酯（MJ）诱导，通过RNA凝胶印迹和半定量RT-PCR分析11个紫杉醇合成相关基因的表达时程，并结合HPLC定量紫杉烷代谢物，系统解析了途径的调控与限速环节。结果显示，MJ诱导后7天紫杉醇和10-去乙酰巴卡亭III均积累至3.3 mg/L，cephalomannine达2.2 mg/L，而未诱导培养中紫杉醇不可检测。表达层面，GGPPS、TASY、T5αH在6小时内即上调，其中TASY和T5αH在未诱导时几乎不表达；途径分支中TαH转录本在6-18小时显著升高，而TDAT和T10βH仅痕量检出，表明碳流优先经TαH分支。值得注意的是，末端BAPT和DBTNBT的转录本丰度远低于早期基因，BAPT在未诱导时有一定表达，DBTNBT则完全不表达，且168小时时两者均不可检测，但代谢物仍持续积累，提示酶活性具有持久性。该结果明确了末端BAPT和DBTNBT为紫杉醇合成的关键限速瓶颈，为靶向过表达这两步酶、提升紫杉醇产量提供了直接依据。
创新点
系统揭示了MJ诱导下紫杉醇途径多个基因表达与代谢物积累的相关性；发现途径早期分支偏向TαH而非TDAT/T10βH；首次指出末端BAPT和DBTNBT转录本丰度极低，是潜在代谢工程靶点
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Taxus cuspidata P991悬浮细胞 | 紫杉醇生物合成途径 | GGPPS | geranylgeranyl pyrophosphate synthase (香叶基香叶基焦磷酸合酶) | 催化 | 催化IPP/DMAPP合成GGPP，MJ诱导后6 h内转录本增加，18 h达峰 |
| Taxus cuspidata P991悬浮细胞 | 紫杉醇生物合成途径 | TASY | taxadiene synthase (紫杉二烯合酶) | 催化 | 催化GGPP环化为taxa-4(5),11(12)-diene，MJ诱导后6 h内上调，18 h最丰富，未诱导时RNA blot不可检测但RT-PCR可检测 |
| Taxus cuspidata P991悬浮细胞 | 紫杉醇生物合成途径 | T5αH | taxadiene 5α-hydroxylase (紫杉二烯5α羟化酶) | 催化 | 细胞色素P450单加氧酶，MJ诱导后6 h表达最高，后下降 |
| Taxus cuspidata P991悬浮细胞 | 紫杉醇生物合成途径 | TDAT | taxadiene 5α-ol O-acetyltransferase (紫杉二烯5α-醇O-乙酰转移酶) | 催化 | 分支旁路酶，仅RT-PCR在MJ诱导6 h检测到痕量表达，丰度极低 |
| Taxus cuspidata P991悬浮细胞 | 紫杉醇生物合成途径 | T10βH | taxane 10β-hydroxylase (紫杉烷10β羟化酶) | 催化 | 细胞色素P450酶，MJ诱导18 h仅RT-PCR检测到极低水平 |
| Taxus cuspidata P991悬浮细胞 | 紫杉醇生物合成途径 | TαH | taxadiene 13α-hydroxylase (紫杉二烯13α羟化酶) | 催化 | 分支关键酶，MJ诱导后6-18 h转录本显著上调，途径优先选择此分支 |
| Taxus cuspidata P991悬浮细胞 | 紫杉醇生物合成途径 | DBBT | taxane 2α-O-benzoyltransferase (紫杉烷2α-O-苯甲酰转移酶) | 催化 | 催化生成10-DAB，MJ诱导后6 h上调，未诱导时RT-PCR仅6 h检测到低水平 |
| Taxus cuspidata P991悬浮细胞 | 紫杉醇生物合成途径 | DBAT | 10-deacetylbaccatin III-10-O-acetyltransferase (10-脱乙酰巴卡亭III-10-O-乙酰转移酶) | 催化 | 催化10-DAB转化为巴卡亭III，MJ诱导后6 h上调，未诱导时低水平表达 |
| Taxus cuspidata P991悬浮细胞 | 紫杉醇生物合成途径 | PAM | phenylalanine aminomutase (苯丙氨酸氨基变位酶) | 催化 | 催化苯丙氨酸生成苯基异丝氨酸，参与紫杉醇侧链合成，MJ诱导后6-18 h高表达，未诱导时也有表达 |
| Taxus cuspidata P991悬浮细胞 | 紫杉醇生物合成途径 | BAPT | baccatin III: 3-amino, 3-phenylpropanoyltransferase (巴卡亭III:3-氨基-3-苯基丙酰转移酶) | 催化 | 催化苯基异丝氨酸连接到巴卡亭III，末端步骤；RNA blot不可检测，RT-PCR显示MJ诱导后6 h表达升高，18 h降低，168 h不可检测 |
| Taxus cuspidata P991悬浮细胞 | 紫杉醇生物合成途径 | DBTNBT | 3'-N-debenzoyl-2-deoxytaxol-N-benzoyltransferase (3'-N-脱苯甲酰-2-脱氧紫杉醇N-苯甲酰转移酶) | 催化 | 催化最终苯甲酰化步骤，末端步骤；未诱导时完全不表达，MJ诱导后6 h出现，18 h增加，但总体丰度极低，是潜在瓶颈 |
关键发现
- MJ诱导后7天，紫杉醇积累至3.3 mg/L，cephalomannine积累至2.2 mg/L，10-去乙酰巴卡亭III(10-DAB)积累至3.3 mg/L，巴卡亭III积累至1.2 mg/L
- 未诱导培养中仅10-DAB低水平积累(0.4-0.8 mg/L)，紫杉醇和cephalomannine不可检测
- GGPPS、TASY、T5αH在MJ诱导后6 h内上调，TASY和T5αH在未诱导时几乎不表达
- 分支中TαH转录本在诱导后6-18 h显著升高，而TDAT和T10βH仅在RT-PCR中痕量检出，表明途径优先通过TαH分支
- DBBT和DBAT在诱导后6 h上调，产物10-DAB和巴卡亭III在转录本增加后6 h内积累
- 末端步骤BAPT和DBTNBT的转录本丰度远低于早期步骤，且BAPT在未诱导时有一定表达，DBTNBT在未诱导时完全不表达，168 h时两者转录本均不可检测，但代谢物仍持续积累，提示酶活性持久性
研究结论
紫杉醇生物合成途径受MJ在mRNA水平调控，早期基因和部分后期基因（DBBT、DBAT、PAM）上调，而末端BAPT和DBTNBT表达极低成为限速瓶颈；途径分支偏好TαH方向。靶向过表达BAPT和DBTNBT有望提高紫杉醇积累。