Multi-dimensional gene target search for improving lycopene biosynthesis in Escherichia coli
- 作者
- Yong-Su Jin, Gregory Stephanopoulos
- 单位
- Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology; Department of Food Science and Biotechnology, Sungkyunkwan University
- 杂志
- Metabolic Engineering（2007）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2007.03.003
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过多维基因靶标搜索策略，结合系统性和组合性方法，识别并组合多个不同作用模式的基因靶标，从而显著提高大肠杆菌中番茄红素的生物合成产量。
研究策略
采用二维搜索策略，将基于化学计量模型预测的敲除靶标与通过基因组文库筛选获得的过表达靶标相结合，构建并评估40个工程菌株，以探索代谢表型空间。
核心内容
本研究采用二维基因靶标搜索策略，将基于化学计量模型预测的敲除靶标与基因组文库筛选获得的过表达靶标进行正交组合，在大肠杆菌中系统构建并评估了40个工程菌株以探索代谢表型空间。研究发现多个新的过表达靶标如yjiD、ycgW、rpoS、appY等，其中单独过表达yjiD和ycgW可使番茄红素产量从150 ppm提升至3500–4500 ppm；过表达rpoS、appY、yggT等靶标使产量相对对照提高约3倍。研究还发现中拷贝质粒对产物积累有不利影响（从4300 ppm降至2100–2500 ppm），而整合表达比质粒表达更为有效。最终通过组合过表达dxs、idi、yjiD-ycgW以及敲除gdhA、aceE、fdhF，最佳菌株WS140在含5 g/L葡萄糖的M9培养基中24小时内积累16000 ppm番茄红素。该工作证明了多维正交搜索策略能有效扩展靶标空间，协同利用敲除与过表达靶标可显著提升代谢产物产量，为微生物细胞工厂的系统性优化提供了可行方法。
创新点
首次将敲除和过表达靶标进行正交组合搜索，发现了新的过表达靶标（如yjiD、ycgW等），并优化出高产菌株。
研究对象（20）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 番茄红素生物合成途径 | crtEBI | 番茄红素合成酶（CrtE、CrtB、CrtI） | 催化 | 异源表达于pACLYC质粒 |
| Escherichia coli | 非甲羟戊酸途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | 过表达靶标 |
| Escherichia coli | 非甲羟戊酸途径 | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 过表达靶标 |
| Escherichia coli | 全局调控 | rpoS | RNA聚合酶σ38因子 | 调控 | 过表达靶标 |
| Escherichia coli | 全局调控 | appY | 调控蛋白AppY | 调控 | 过表达靶标 |
| Escherichia coli | 未知 | yjiD | 假定蛋白YjiD | 调控 | 过表达靶标，推测通过调控方式影响番茄红素积累；同时其启动子区域插入被鉴定为敲除靶标 |
| Escherichia coli | 未知 | ycgW | 假定蛋白YcgW（ElhA） | 调控 | 过表达靶标，推测参与异戊二烯生物合成早期步骤的调控 |
| Escherichia coli | 未知 | yhbL | 假定蛋白YhbL（ElhB） | 调控 | 过表达靶标，推测参与异戊二烯生物合成早期步骤的调控 |
| Escherichia coli | 嘌呤代谢 | purDH | 磷酸核糖胺-甘氨酸连接酶/AICAR转化酶/IMP环水解酶 | 催化 | 过表达靶标 |
| Escherichia coli | 未知 | yggT | 假定耐药蛋白YggT | 调控 | 过表达靶标，功能未知，推测为调控 |
| Escherichia coli | 未知 | yfjN | 假定细胞分裂蛋白YfjN | 调控 | 过表达靶标，功能未知，推测为调控 |
| Escherichia coli | 厌氧呼吸 | torC | 三甲胺N-氧化物还原酶细胞色素c亚基 | 催化 | 过表达靶标 |
| Escherichia coli | 氧化还原代谢 | ydgK | 假定氧化还原酶YdgK | 催化 | 过表达靶标 |
| Escherichia coli | 嘧啶代谢 | yeiA | 假定二氢嘧啶脱氢酶YeiA | 催化 | 过表达靶标 |
| Escherichia coli | 未知 | yedR | 假定蛋白YedR | 调控 | 过表达靶标，功能未知 |
| Escherichia coli | 信号转导 | torT | 诱导子结合蛋白TorT | 调控 | 过表达靶标 |
| Escherichia coli | 中心碳代谢 | gdhA | 谷氨酸脱氢酶 | 催化 | 敲除靶标 |
| Escherichia coli | 中心碳代谢 | aceE | 丙酮酸脱氢酶E1组分 | 催化 | 敲除靶标 |
| Escherichia coli | 中心碳代谢 | fdhF | 甲酸脱氢酶H | 催化 | 敲除靶标 |
| Escherichia coli | 中心碳代谢 | gpmB | 磷酸甘油酸变位酶B | 催化 | 敲除靶标 |
关键发现
最佳菌株（WS140 T5p-dxs, T5p-idi, rrnBp-yjiD-ycgW, ΔgdhAΔaceEΔfdhF, pACLYC）在24小时内积累16000 ppm（16 mg/g细胞）的番茄红素，在含5 g/L葡萄糖的M9最小培养基中。相比于对照菌株，过表达rpoS、appY、yggT、purDH、yfjN使产量提高约3倍（6000-9000 ppm vs 2400 ppm）。高拷贝质粒中yjiD和ycgW过表达使产量从150 ppm提高到3500-4500 ppm。中拷贝质粒对番茄红素积累有不利影响，从4300 ppm降至2100-2500 ppm。在2XM9培养基中，过表达yjiD使产量提高70-100%，且在三重敲除背景下达到14442 ppm。整合表达比质粒表达更有效，最终实现16000 ppm。
研究结论
多维搜索策略有效地扩展了基因靶标搜索空间，组合过表达和敲除靶标可以协同提高番茄红素产量，证明了正交搜索方法在代谢工程中的有效性。