Microbial sensors for small molecules: Development of a mevalonate biosensor
- 作者
- Brian F. Pfleger, Douglas J. Pitera, Jack D. Newman, Vincent J.J. Martin, Jay D. Keasling
- 单位
- Department of Chemical Engineering, University of California Berkeley; Department of Bioengineering, University of California Berkeley; Synthetic Biology Department, Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory
- 杂志
- Metabolic Engineering（2006）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2006.08.002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏对非显色小分子（如甲羟戊酸）的高通量定量筛选方法，限制了代谢途径突变库的高效筛选。
研究策略
构建大肠杆菌甲羟戊酸营养缺陷型菌株，使其生长依赖于外源甲羟戊酸，并通过组成型表达GFP将生长速率转化为荧光信号；建立底物抑制型Monod模型定量解释生长速率与甲羟戊酸浓度的关系，用于高通量筛选和定量测量。
核心内容
针对甲羟戊酸等非显色小分子缺乏高通量定量筛选方法的问题，本研究构建了一种基于大肠杆菌营养缺陷型的新型微生物传感器。研究者将甲羟戊酸途径关键基因整合至底盘菌株，构建了生长严格依赖外源甲羟戊酸的营养缺陷型菌株，并通过组成型表达绿色荧光蛋白将生长速率转化为可测的荧光信号，同时建立底物抑制型Monod模型以定量描述生长速率与甲羟戊酸浓度的关系。该传感器在50 μM至10 mM浓度范围内实现了准确拟合，Z'因子约0.9，达到优异筛选水平，可辨别10%的产量差异。利用该系统筛选600多个突变菌落，鉴定出4株产量较原始菌株高出7倍的突变体，且定量结果与GC-MS高度一致。该工作提供了一种无需昂贵色谱设备即可实现小分子高通量定量的通用策略，为代谢途径突变库的高效筛选提供了简便经济的新工具，并有望推广至其他可开发营养缺陷型的分子体系。
创新点
首次利用营养缺陷型菌株作为小分子生物传感器，通过生长速率偶联荧光报告实现小分子检测，无需昂贵色谱设备，可推广至其他可开发营养缺陷型的分子。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | ERG12 | 甲羟戊酸激酶（MK） | 催化 | MBIS操纵子中，催化甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | ERG8 | 磷酸甲羟戊酸激酶（PMK） | 催化 | MBIS操纵子中，催化甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化为甲羟戊酸-5-二磷酸 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | MVD1 | 甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶（MPD） | 催化 | MBIS操纵子中，催化甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧生成异戊烯基焦磷酸（IPP） |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | idi | 异戊烯基焦磷酸异构酶（IPP isomerase） | 催化 | MBIS操纵子中，催化IPP与DMAPP的相互转化 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | ispA | 法尼基焦磷酸合酶（FPP synthase） | 催化 | MBIS操纵子中，催化IPP和DMAPP缩合生成FPP |
| Escherichia coli | DXP途径 | ispC (dxr) | DXP还原异构酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase） | 催化 | 编码基因被敲除，以阻断内源DXP途径，使菌株依赖外源甲羟戊酸生长 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | atoB | 乙酰乙酰辅酶A硫解酶 | 催化 | 来自pMevT，催化两分子乙酰辅酶A缩合生成乙酰乙酰辅酶A |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | HMGS | HMG-CoA合酶 | 催化 | 来自pMevT，催化乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合生成HMG-CoA |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | tHMGR | 截短的HMG-CoA还原酶 | 催化 | 来自pMevT，催化HMG-CoA还原生成甲羟戊酸 |
关键发现
- 构建了大肠杆菌甲羟戊酸营养缺陷型生物传感器（DP5+pKLN59），其生长速率与甲羟戊酸浓度呈底物抑制型Monod关系，模型在0~700 μM内准确拟合（50 μM~10 mM范围内测试）
- Z'分数约0.9，Z分数（OD600）最大0.9、荧光最大0.7，属于"excellent assay"水平
- 筛选600多个甲羟戊酸生产菌落，18%显著高于对照，平均标准偏差0.04 RFU，可辨别10%的产量提升（95%置信度）
- 鉴定出4株产量比原始菌株高7倍的突变体
- 与GC-MS相比，生物传感器定量结果几乎一致，仅有轻微系统性高估。
研究结论
开发了一种简单、经济、高通量的微生物生物传感器方法，利用营养缺陷型生长偶联荧光报告准确定量甲羟戊酸，可有效筛选代谢途径突变库，并有望推广至其他可被细胞摄取和代谢的小分子。