Engineering a β-carotene ketolase for astaxanthin production
- 作者
- Luan Tao, Jolanta Wilczek, J. Martin Odom, Qiong Cheng
- 单位
- Biological and Chemical Sciences and Engineering, Central Research and Development, E. I. DuPont de Nemours Inc., Wilmington, DE 19880-0328, USA
- 杂志
- Metabolic Engineering（2006）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2006.06.001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
虾青素生物合成中，β-胡萝卜素酮醇酶（CrtW）对羟基化类胡萝卜素（如玉米黄质、adonixanthin）活性低，导致虾青素转化率低，成为合成瓶颈。
研究策略
从环境分离株Sphingomonas sp. DC18克隆新的crtW基因，构建基于颜色变化的高通量筛选方法，通过易错PCR对crtW基因及其上游核糖体结合位点（RBS）进行随机突变，筛选提高虾青素产量的突变体，并组合有益突变。
核心内容
本研究针对虾青素生物合成中β-胡萝卜素酮醇酶（CrtW）对羟基化类胡萝卜素底物活性低、导致虾青素转化率低下的瓶颈问题，从环境分离株Sphingomonas sp. DC18中克隆了新的crtW基因，并构建了基于颜色变化的高通量筛选系统，通过易错PCR对crtW编码区及其上游核糖体结合位点（RBS）进行随机突变与组合优化。结果显示，野生型CrtW在大肠杆菌中仅将14%的类胡萝卜素转化为虾青素，而最优突变体MM1可使该比例提升至83%；进一步将MM1突变与RBS突变（a438t）组合后，虾青素占总类胡萝卜素比例达到91%。所有有益突变均集中在保守组氨酸基序HisII/HisIII附近，提示这些区域对底物特异性具有关键调控作用。将a438t RBS突变引入含R203W等突变的MM2菌株使虾青素产量提高2倍。该研究证明定向进化策略可有效改善CrtW对羟基化类胡萝卜素的催化活性，为虾青素及其他高值类胡萝卜素的微生物高效合成提供了可行途径。
创新点
开发了可靠的基于颜色的筛选系统（通过降低trc启动子强度实现）；从Sphingomonas sp. DC18克隆了新的crtW基因；鉴定出多个位于保守组氨酸基序附近的有益突变；发现RBS突变（a438t）对虾青素产量有额外的促进作用；通过组合突变实现虾青素占总类胡萝卜素比例达91%。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli 10G | 类胡萝卜素/虾青素生物合成 | crtE, crtI, crtY, crtB, idi | CrtE, CrtI, CrtY, CrtB, Idi | 催化 | β-胡萝卜素合成基因簇，来自pDCQ330/DC404，用于提供β-胡萝卜素前体 |
| Escherichia coli 10G | 类胡萝卜素/虾青素生物合成 | crtW | CrtW (β-胡萝卜素酮醇酶) | 催化 | 来自Sphingomonas sp. DC18，催化β-胡萝卜素及羟基化类胡萝卜素的4,4'-酮基化 |
| Escherichia coli 10G | 类胡萝卜素/虾青素生物合成 | crtZ | CrtZ (β-胡萝卜素羟化酶) | 催化 | 来自Pantoea agglomerans DC404，催化3,3'-羟基化，用于构建玉米黄质报告菌株 |
| Escherichia coli 10G | 类胡萝卜素/虾青素生物合成 | crtW (F213L) | CrtW (F213L突变体) | 催化 | 单突变体，虾青素产量约77%，对β-胡萝卜素活性降低，canthaxanthin产量约85%（48h） |
| Escherichia coli 10G | 类胡萝卜素/虾青素生物合成 | crtW (R203W/F213L) | CrtW (R203W/F213L双突变体) | 催化 | 组合突变体，虾青素产量88%，canthaxanthin产量降低 |
| Escherichia coli 10G | 类胡萝卜素/虾青素生物合成 | crtW 上游RBS (a438t) | — | 调控 | 核糖体结合位点突变，提高翻译效率，对虾青素产量有额外促进作用 |
| Sphingomonas sp. DC18 | 类胡萝卜素生物合成 | — | — | 催化 | 环境分离株，crtW基因的来源菌株，主要积累二羟基adonixanthin |
关键发现
- 野生型CrtW在玉米黄质积累的大肠杆菌中仅产生14%虾青素
- 最佳突变体MM1产生83%虾青素
- F213L单突变体产生约77%虾青素
- R203W/F213L双突变体产生88%虾青素
- 将MM1突变与RBS突变（a438t）组合后产生91%虾青素
- 将a438t RBS突变引入MM2（含R203W等突变）使虾青素产量提高2倍
- F213L单突变和R203W/F213L双突变在β-胡萝卜素积累菌株中产生canthaxanthin约为85%（48h），低于野生型的98%，但虾青素产量提高约6倍
- 所有有益突变集中在保守组氨酸基序（HisII/HisIII）附近，H96L位于HisII上游三个残基处，其余（R203W, A205V, A208V, F213L, A215T）位于HisIII上游。
研究结论
通过蛋白质工程有效提高了Sphingomonas sp. DC18的CrtW对羟基化类胡萝卜素的活性，显著提高了虾青素转化率，证明定向进化是改善虾青素合成瓶颈的有效手段。