Selection and optimization of microbial hosts for biofuels production
- 作者
- Curt R. Fischer, Daniel Klein- Marcuschamer, Gregory Stephanopoulos
- 单位
- Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology
- 杂志
- Metabolic Engineering（2008）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2008.06.009
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
第二代生物燃料（正丁醇、2-丁醇、萜类、高级脂质）商业化生产的主要障碍是缺乏具有稳健产量、生产率和滴度且能耐受过程胁迫（如产物毒性和发酵抑制物）的微生物宿主菌株。
研究策略
系统评述了四种原料（糖/淀粉、木质纤维素、合成气、CO2）和四种产品（正丁醇、2-丁醇、萜类、脂质）的代谢途径，实验测试了七种快速生长的兼性厌氧宿主对丁醇和玉米秸秆水解液等生产胁迫的耐受性，并讨论理性与随机代谢工程策略（如全局转录机器工程、人工转录因子、基因组改组等）用于宿主改良。
核心内容
该文系统评估了第二代生物燃料商业化生产中的核心瓶颈——缺乏兼具高产量、高生产率和强胁迫耐受性的微生物宿主。研究比较了糖/淀粉、木质纤维素、合成气和CO2四种原料路线，以及正丁醇、2-丁醇、萜类和脂质四类产品的代谢合成途径，并通过统一条件下的实验，测定了七种快速生长的兼性厌氧宿主对丁醇和玉米秸秆水解液的耐受性。结果显示，枯草芽孢杆菌对1-丁醇耐受力远高于其他菌株，但对水解液敏感；谷氨酸棒杆菌则相反，而酿酒酵母和解脂耶氏酵母对两种胁迫均表现较好。在已有工艺中，玉米乙醇发酵滴度约9 wt%，达到理论产率的93.6-95.8%；梭菌正丁醇典型滴度为13 g/L，产率达0.76 mol/mol，分离能耗约5 MJ/kg。文章还讨论了全局转录机器工程、人工转录因子及基因组改组等宿主改良策略，指出产量最易通过代谢工程优化，而生产率和滴度受制于对胁迫耐受机制认识的不足，选择合适宿主并发展全局工程方法是突破方向。
创新点
通过统一条件实验比较了七种常见宿主对丁醇和预处理水解液抑制物的耐受性，为宿主选择提供了直接数据；分析了产物滴度对分离能耗的影响，指出丁醇等产物比乙醇更易分离。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 乙醇合成 | ADH6 | 5-羟甲基糠醛还原酶 | 催化 | 过表达增强HMF还原转化 |
| Saccharomyces cerevisiae | 磷酸戊糖途径 | ZWF1 | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 | 催化 | 过表达提高糠醛耐受性 |
| Saccharomyces cerevisiae | 苯丙酸代谢 | PAD1 | 苯丙烯酸脱羧酶 | 催化 | 过表达提高阿魏酸和肉桂酸存在下的乙醇生产率 |
| Saccharomyces cerevisiae | 色氨酸生物合成 | TRP1-5 | 色氨酸生物合成酶 | 催化 | 过表达增强乙醇耐受性 |
| Saccharomyces cerevisiae | 全局转录调控 | SPT15 | TATA盒结合蛋白 | 调控 | 突变提高高糖高乙醇耐受性 |
| Saccharomyces cerevisiae | 嘧啶代谢 | URA7 | CTP合成酶 | 催化 | 敲除提高乙醇耐受性 |
| Saccharomyces cerevisiae | 半乳糖代谢 | GAL6 | — | 催化 | 敲除提高乙醇耐受性 |
| Clostridium acetobutylicum | 溶剂生成 | spo0A | Spo0A | 调控 | 控制从产酸到产溶剂的转换 |
| Clostridium thermoaceticum | Wood-Ljungdahl途径 | acsAB | 乙酰辅酶A合酶（ACS） | 催化 | 在E. coli中异源表达具有活性 |
| Clostridium carboxidivorans | 一氧化碳氧化 | CODH | 一氧化碳脱氢酶 | 催化 | 催化CO氧化为CO2并提供还原力 |
| Chlamydomonas reinhardtii | Calvin循环 | rbcL | Rubisco | 催化 | 固定CO2的关键酶 |
| Bacillus subtilis | 渗透保护物质转运 | — | Opu转运蛋白 | 转运 | 参与甘氨酸甜菜碱等相容性溶质的摄取，提供热保护 |
关键发现
- 玉米乙醇工业产率2.65-2.71 gal/bushel（0.388-0.397 L/kg），达理论最大93.6-95.8%，发酵后乙醇滴度约9 wt%。
- 梭菌正丁醇典型滴度13 g/L，丁醇产率0.76 mol/mol（对葡萄糖），生产率0.76 g/L/h（氢气曝气）。
- 合成气乙醇发酵：CO的理论产率45%，生产率约1 g/L/day，滴度达3 g/L。
- 室外藻池细胞密度0.5-1.0 g/L干重，产率15-20 g/m2/d，脂质含量约40%（w/w），比生长速率约2 d^-1；光生物反应器细胞密度可达20 g/L。
- 倍半萜类阿莫二烯代表滴度约0.5 g/L。
- 分离9 wt%乙醇所需能耗约5 MJ/kg。
- 耐受性测试中，B. subtilis对1-丁醇耐受性远高于其他六种，但对玉米秸秆水解液（CSH）敏感；C. glutamicum相反；S. cerevisiae和Yarrowia lipolytica对两种胁迫均较耐受。
- 过表达ADH6、ZWF1、PAD1等可增强酵母对抑制剂耐受性；过表达hsp22.4使酵母在51°C 4小时存活率提高；SPT15突变提高高糖/乙醇耐受；ura7和gal6敲除使酵母在8%乙醇存在下生长和葡萄糖消耗更快。
研究结论
当前主要微生物生物燃料是淀粉基乙醇，未来需转向木质纤维素。第二代生物燃料（丁醇、脂质、萜类）在能量密度、水混性和基础设施兼容性方面更优，但主要障碍是微生物性能不足。产量最易通过代谢工程优化，而生产率和滴度受限于对胁迫耐受机制的认识不足，需进一步研究。选择适当宿主并发展全局工程方法是关键。