Establishment of a novel anabolism-based addiction system with an artificially introduced mevalonate pathway: Complete stabilization of plasmids as universal application in white biotechnology
- 作者
- Jens Kroll, Anna Steinle, Rudolf Reichelt, Christian Evering, Alexander Steinbüchel
- 单位
- Institut für Molekulare Mikrobiologie und Biotechnologie, Westfälische Wilhelms-Universität; Institut für Medizinische Physik und Biophysik, Elektronenmikroskopie und Analytik, Universitätsklinikum Münster, Westfälische Wilhelms-Universität
- 杂志
- Metabolic Engineering（2009）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2009.01.007
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
传统基于抗生素选择的质粒表达系统在长期或高密度培养过程中质粒不稳定，导致产物产量下降；现有各类成瘾系统也未能实现完全质粒稳定，且部分依赖特定培养基。
研究策略
利用异戊烯焦磷酸（IPP）为必需代谢物，建立合成代谢型成瘾系统：敲除大肠杆菌染色体上的 ispH 基因（阻断内源 DXP 通路 IPP 合成），同时在质粒上编码完整的、经密码子优化的人工甲羟戊酸（MVA）通路作为替代 IPP 供给源，使宿主必须保留该质粒才能存活，从而强制质粒稳定。
核心内容
本研究构建了一种基于合成代谢的新型质粒成瘾系统，以解决传统抗生素选择系统在长期或高密度培养中质粒不稳定、产物产量下降的问题。作者敲除大肠杆菌染色体上的ispH基因，阻断内源DXP通路合成必需代谢物异戊烯焦磷酸（IPP），同时在质粒上编码经过密码子优化的人工甲羟戊酸（MVA）通路作为替代IPP供给源，使宿主菌必须保留该质粒方能存活，从而实现质粒的强制稳定。在无抗生素培养条件下，该ΔispH/MVA成瘾系统菌株的质粒稳定性达到100%，而对照菌株分别仅为64%和2%。在氰基蛋白生产中，敲除突变株有/无抗生素条件下CGP含量分别达9.40%和9.52%（w/w CDW），而对照在无抗生素时CGP含量为0%。该研究首次建立了基于合成代谢的成瘾系统，无需抗生素即可在复杂培养基中实现质粒完全稳定，为白色生物技术提供了一种通用型质粒稳定平台。
创新点
首次建立基于合成代谢（anabolism）的成瘾系统；完全人工合成并密码子优化的 MVA 基因簇（MVA1-5）；引入双 HMG-CoA 还原酶以绕过该步瓶颈；首次证明金黄色葡萄球菌的 MVPP 脱羧酶在大肠杆菌中有功能；系统无需抗生素、可在复杂培养基中实现 100% 质粒稳定。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli HMS174(DE3) ΔispH::FRT/Amp/FRT | DXP 通路（非甲羟戊酸异戊二烯生物合成） | ispH (lytB) | 4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶 (IspH) | 催化 | 该基因被敲除，阻断内源 IPP 合成，是成瘾系统的选择压力核心 |
| Escherichia coli HMS174(DE3) (含质粒 pCOLADuet-1::MVA1-5) | 甲羟戊酸（MVA）通路 | — | HMG-CoA 还原酶（来自 Lactococcus lactis） | 催化 | MVA 通路中的限速酶，双拷贝表达以绕过瓶颈 |
| Escherichia coli HMS174(DE3) (含质粒 pCOLADuet-1::MVA1-5) | 甲羟戊酸（MVA）通路 | — | HMG-CoA 还原酶（来自 Staphylococcus aureus） | 催化 | 与 L. lactis 来源的酶共同表达 |
| Escherichia coli HMS174(DE3) (含质粒 pCOLADuet-1::MVA1-5) | 甲羟戊酸（MVA）通路 | — | HMG-CoA 合酶（来自 Staphylococcus aureus） | 催化 | 催化乙酰-CoA 与乙酰乙酰-CoA 缩合 |
| Escherichia coli HMS174(DE3) (含质粒 pCOLADuet-1::MVA1-5) | 甲羟戊酸（MVA）通路 | — | 甲羟戊酸激酶（MVA kinase, 来自 Staphylococcus aureus） | 催化 | MVA 通路磷酸化步骤 |
| Escherichia coli HMS174(DE3) (含质粒 pCOLADuet-1::MVA1-5) | 甲羟戊酸（MVA）通路 | — | 磷酸甲羟戊酸激酶（MVP kinase, 来自 Staphylococcus aureus） | 催化 | MVA 通路磷酸化步骤 |
| Escherichia coli HMS174(DE3) (含质粒 pCOLADuet-1::MVA1-5) | 甲羟戊酸（MVA）通路 | — | 二磷酸甲羟戊酸脱羧酶（MVPP decarboxylase, 来自 Staphylococcus aureus） | 催化 | 首次证明该酶在大肠杆菌中有功能 |
| Escherichia coli HMS174(DE3) (含质粒 pCOLADuet-1::MVA1-5::cphA6308) | 氰基蛋白（CGP）合成 | cphA6308 (C595S) | 氰基蛋白合成酶（CphA） | 催化 | 源自 Synechocystis sp. PCC 6308，携带 C595S 点突变，用于生产 CGP 聚合物 |
关键发现
- 在无抗生素培养中，ΔispH/MVA 成瘾系统菌株质粒稳定性达 100%，而对照菌株 pCOLADuet-1::MVA1-5::cphA6308 和 pET-23a::cphA6308 的质粒稳定性分别仅为 64% 和 2%（质粒丢失 98%）。敲除突变株在有/无抗生素条件下氰基蛋白（CGP）含量分别为
- 40% 和
- 52%（w/w CDW），CphA 酶活分别为
- 41 和
- 44 U/mg 蛋白；而 pET-23a 对照在无抗生素时 CGP 含量为 0%，酶活仅
- 04 U/mg 蛋白。带 pCOLADuet-1::MVA1-5::cphA6308 的对照在添加抗生素时 CGP 含量达
- 60%（w/w CDW），酶活
- 70 U/mg 蛋白。
研究结论
所构建的基于合成代谢的 ΔispH/MVA 成瘾系统可在无抗生素条件下赋予大肠杆菌 100% 的质粒稳定性，显著优于传统抗生素选择系统，并适用于复杂培养基，可作为白色生物技术中通用型质粒稳定平台。