Combinatorial pathway analysis for improved L-tyrosine production in Escherichia coli: Identification of enzymatic bottlenecks by systematic gene overexpression
- 作者
- Tina Lütke-Eversloh, Gregory Stephanopoulos
- 单位
- Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology
- 杂志
- Metabolic Engineering（2008）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2007.12.001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
识别大肠杆菌L-酪氨酸生产中芳香族氨基酸生物合成（AAAB）途径中限制产量的酶促瓶颈
研究策略
在L-酪氨酸生产菌株E. coli T1和T2中，对AAAB途径除aroG和tyrA（已由反馈抗性突变体替代）外的全部基因进行组合过表达，构建72个不同菌株，通过表型筛选推断瓶颈步骤
核心内容
该研究在大肠杆菌L-酪氨酸生产菌株T1和T2中，对芳香族氨基酸生物合成途径中除反馈抗性突变体aroG和tyrA外的全部基因进行系统性组合过表达，构建了72个不同菌株，通过表型筛选识别限速瓶颈。研究发现，单独过表达ydiB（莽草酸脱氢酶旁系同源）可使两菌株产量提升约20%，而组合过表达ydiB和aroK（莽草酸激酶I）效果更显著，使T1和T2的L-酪氨酸产量分别提高45%和26%，最佳菌株产量达到270和360 mg/g细胞干重，摇瓶最大浓度约700 mg/L。此外发现aroA过表达仅在T2中有效，与PEP供应相关；tyrB单独过表达无效但与其它基因组合时具协同效应。产量提升伴随生长速率降低，如T1从0.62 h⁻¹降至0.57 h⁻¹。该工作表明组合基因过表达是识别代谢瓶颈的有效策略，并能发现单独过表达无法揭示的协同靶点，ydiB、aroK和tyrB可作为提高大肠杆菌L-酪氨酸生产的关键工程靶点。
创新点
采用系统性组合基因过表达方法，不依赖中间代谢物浓度或生化调控知识；发现ydiB（莽草酸脱氢酶）和aroK（莽草酸激酶I）作为新的代谢工程靶点；发现单独过表达无效但与其他基因组合时有效的靶点（如tyrB）
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli T1 | 芳香族氨基酸生物合成（AAAB）途径 | aroG | 3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸（DAHP）合酶 | 催化 | 反馈抑制抗性突变体（aroGfbr）在宿主菌中已过表达 |
| Escherichia coli T1 | 芳香族氨基酸生物合成（AAAB）途径 | tyrA | 分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶 | 催化 | 反馈抑制抗性突变体（tyrAfbr）在宿主菌中已过表达 |
| Escherichia coli T1 | 芳香族氨基酸生物合成（AAAB）途径 | ydiB | 莽草酸脱氢酶（旁系同源） | 催化 | 单基因过表达使产量提高约20%，与aroK组合效果最佳 |
| Escherichia coli T1 | 芳香族氨基酸生物合成（AAAB）途径 | aroK | 莽草酸激酶I | 催化 | 单基因过表达提高产量，与ydiB组合最佳 |
| Escherichia coli T1 | 芳香族氨基酸生物合成（AAAB）途径 | aroL | 莽草酸激酶II | 催化 | 单基因过表达在T1中有效，但效果弱于aroK |
| Escherichia coli T2 | 芳香族氨基酸生物合成（AAAB）途径 | aroA | 5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸（EPSP）合酶 | 催化 | 仅在T2中有效，与PEP前体供应相关 |
| Escherichia coli T1 | 芳香族氨基酸生物合成（AAAB）途径 | tyrB | 芳香族氨基酸转氨酶 | 催化 | 单独过表达无效，但与ydiB或aroK共同过表达显著提高产量 |
| Escherichia coli T1 | 芳香族氨基酸生物合成（AAAB）途径 | aroB | 3-脱氢奎尼酸合酶 | 催化 | 与ydiB组合时在两种菌株中均提高产量 |
| Escherichia coli T1 | 芳香族氨基酸生物合成（AAAB）途径 | aroD | 3-脱氢奎尼酸脱水酶 | 催化 | 参与AAAB途径，未作为主要靶点 |
| Escherichia coli T1 | 芳香族氨基酸生物合成（AAAB）途径 | aroE | 莽草酸脱氢酶（反馈抑制型） | 催化 | 过表达未提高产量，与ydiB不同 |
| Escherichia coli T1 | 芳香族氨基酸生物合成（AAAB）途径 | aroC | 分支酸合酶 | 催化 | 与ydiB或aroK组合时在T1中有效 |
| Escherichia coli T2 | 前体供给（PEP和E4P） | ppsA | 磷酸烯醇丙酮酸合酶 | 能量供给 | T2菌株背景中过表达以增加PEP供给 |
| Escherichia coli T2 | 前体供给（PEP和E4P） | tktA | 转酮醇酶 | 催化 | T2菌株背景中过表达以增加E4P供给 |
关键发现
- 组合过表达ydiB和aroK使E. coli T1的L-酪氨酸产量提高45%，T2提高26%
- 最佳菌株产量分别达到270和360 mg L-酪氨酸/g细胞干重
- 摇瓶实验中最大L-酪氨酸浓度约为700 mg/L
- E. coli T1（初始产量较低）比T2具有更大的表型提升空间
- 单独过表达ydiB可使两菌株产量增加约20%
- aroA过表达仅在T2中有效，原因与前体PEP供应相关
- 生长速率测定：T1为0.62 h⁻¹，T1-YK为0.57 h⁻¹，T2为0.52 h⁻¹，T2-YK为0.46 h⁻¹，产量提高伴随生长速率降低
研究结论
组合基因过表达是识别代谢途径瓶颈的有效工具，ydiB、aroK和tyrB是提高大肠杆菌L-酪氨酸生产的关键过表达靶点，系统过表达还可发现单独过表达无法识别的协同靶点