Reconstruction of the archaeal isoprenoid ether lipid biosynthesis pathway in Escherichia coli through digeranylgeranylglyceryl phosphate
- 作者
- Denton Lai, Ben Lluncor, Imke Schroder, Robert P. Gunsalus, James C. Liao, Harold G. Monbouquette
- 单位
- Chemical and Biomolecular Engineering Department, University of California, Box 951592, Los Angeles, CA 90095-1592, USA; Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics Department, University of California, Los Angeles, CA 90095, USA
- 杂志
- Metabolic Engineering（2009）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2009.01.008
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
古菌类异戊二烯醚脂质生物合成途径中四醚脂质（caldarchaeol）的头对头偶联等下游步骤涉及未知酶，缺乏用于途径解析的异源生产平台；此前尚无在大肠杆菌中重构古菌醚脂质生物合成途径的先例。
研究策略
将来自超嗜热古菌Archaeoglobus fulgidus的四个醚脂质合成基因（egsA、gps、GGGPS、DGGGPS）与大肠杆菌内源的idi基因一起，通过两个可控表达载体（pDL11和pDL6）在E. coli TOP10中异源表达，重构从简单前体到DGGGP的合成途径，并用LC/MS/MS验证产物。
核心内容
本研究在大肠杆菌TOP10中首次重构了古菌类异戊二烯醚脂质生物合成途径，将来自超嗜热古菌Archaeoglobus fulgidus的四个关键基因（egsA、gps、GGGPS、DGGGPS）与大肠杆菌内源idi基因通过两个可控表达载体协同表达，实现了从简单前体到双香叶基香叶基甘油磷酸（DGGGP）的从头合成。通过LC/MS/MS锂离子加合技术，研究在体内检测到DGGGP的脱磷酸产物DGGG，其特征加合峰为m/z 643.3，碎片离子包括m/z 371.2（GGG）、m/z 279.3（C20异戊二烯链）和m/z 99.0（甘油骨架），确证了完整途径的打通。酶活测定显示G1P脱氢酶在60°C下比活性达4 U/mg，GGGP合酶在60°C和37°C下均能完全转化底物。值得注意的是，尽管Western blot未检测到DGGGP合酶蛋白条带，其体内催化活性仍得到功能验证，暗示该酶可能在异源环境中表达量较低但功能正常。该工程菌株与灵敏的LC/MS/MS分析方法共同构成了一个实用的异源生产平台，为后续解析四醚脂质途径中从DGGGP出发的头对头偶联等未知酶促步骤提供了关键工具。
创新点
['首次在大肠杆菌中代谢工程重构古菌异戊二烯醚脂质生物合成途径，实现DGGGP的生产。', '首次证实A. fulgidus中存在G1P脱氢酶（egsA）和DGGGP合酶（DGGGPS）的功能。', '通过LC/MS/MS锂离子加合技术确认了DGGGP的体内合成，为下游四醚脂质途径未知酶的鉴定提供了平台。']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli TOP10 | 类异戊二烯/异戊二烯醚脂质生物合成途径 | idi | 异戊烯基焦磷酸异构酶（IPP isomerase） | 催化 | 来自大肠杆菌，提高DMAPP供应，置于pDL11中受lac启动子控制 |
| Escherichia coli TOP10 | 类异戊二烯/异戊二烯醚脂质生物合成途径 | gps | GGPP合酶（geranylgeranyl diphosphate synthase） | 催化 | 来自A. fulgidus，催化DMAPP链延伸生成GGPP，置于pDL11中 |
| Escherichia coli TOP10 | 类异戊二烯/异戊二烯醚脂质生物合成途径 | egsA (AF1674) | 甘油-1-磷酸脱氢酶（G1P dehydrogenase） | 催化 | 来自A. fulgidus，催化DHAP生成G1P，带C端6×His标签，置于pDL11中 |
| Escherichia coli TOP10 | 类异戊二烯/异戊二烯醚脂质生物合成途径 | GGGPS (AF0403) | GGGP合酶（geranylgeranylglyceryl phosphate synthase） | 催化 | 来自A. fulgidus，催化GGPP与G1P缩合生成GGGP，带N端6×His标签，置于pDL6中受araBAD启动子控制 |
| Escherichia coli TOP10 | 类异戊二烯/异戊二烯醚脂质生物合成途径 | DGGGPS (AF0404) | DGGGP合酶（digeranylgeranylglyceryl phosphate synthase） | 催化 | 来自A. fulgidus，膜整合蛋白，催化第二个GGPP连接生成DGGGP，带C端6×His标签，置于pDL6中 |
关键发现
- ['成功重构途径，LC/MS/MS检测到DGGG（DGGGP脱磷酸产物），其锂离子加合峰为m/z
- 3，MS/MS碎片包括m/z
- 2（GGG）、m/z
- 3（C20异戊二烯链）和m/z
- 0（甘油骨架）。', 'GGG的锂离子加合峰为m/z
- 5，MS/MS碎片为m/z
- 3和m/z
- 0。', 'G1P脱氢酶在60°C下比活性为4 U/mg，在37°C下为0.6 U/mg。', 'GGGP合酶体外放射性测定显示3H-GGPP在60°C和37°C下均完全转化为3H-GGGP；TLC中GG的Rf为0.32，GGG的Rf为0.42；HPLC中GGG保留时间13.8 min，GGGP产物保留时间12.5 min。', '表达idi和gps的菌株产生深红色菌落（番茄红素），仅表达gps的菌株为粉红色，对照为白色。', 'Western blot检测到G1P脱氢酶（39.4 kDa）和GGGP合酶（30.4 kDa）的表达；DGGGP合酶（预期33.6 kDa）未检测到，但体内活性得到证实。']
研究结论
通过在大肠杆菌中表达来自A. fulgidus的egsA、gps、GGGPS和DGGGPS以及大肠杆菌的idi，成功构建了能够从简单代谢前体合成DGGGP的工程菌株。该菌株和LC/MS/MS分析方法可作为工具，用于进一步鉴定四醚脂质生物合成途径中从DGGGP出发的后续未知步骤（如头对头偶联反应）。