Metabolic engineering of cyanobacteria for 1-butanol production from carbon dioxide
- 作者
- Ethan I. Lan, James C. Liao
- 单位
- Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California, Los Angeles, CA 90095, USA; Biomedical Engineering IDP, University of California, Los Angeles, CA 90095, USA
- 杂志
- Metabolic Engineering（2011）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2011.04.004
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在蓝细菌中构建利用CO2合成1-丁醇的代谢途径，解决途径酶表达、氧敏感性和关键酶Ter活性不足等问题。
研究策略
将来自大肠杆菌、丙酮丁醇梭菌和齿垢密螺旋体的五个基因（atoB、hbd、crt、ter、adhE2）整合到聚球藻PCC 7942基因组中，用NADH依赖的Ter替代氧敏感的梭菌Bcd/Etf复合体，并通过His标签提高Ter活性，在黑暗厌氧条件下实现从CO2生产1-丁醇。
核心内容
本研究在蓝细菌聚球藻PCC 7942中构建了CoA依赖的1-丁醇合成途径，将来自大肠杆菌、丙酮丁醇梭菌和齿垢密螺旋体的五个基因（atoB、hbd、crt、ter、adhE2）整合至其基因组，利用CO2和光能实现自养生产1-丁醇。针对梭菌途径中氧敏感的Bcd/Etf复合体，作者采用齿垢密螺旋体的反式-2-烯酰-CoA还原酶（Ter）替代，并通过His标签将其活性从0.0021 μmol/min/mg提高至0.444 μmol/min/mg，提升超100倍，使1-丁醇产量提高约5倍。工程菌EL14在黑暗厌氧条件下培养7天累积1-丁醇14.5 mg/L，细胞密度从OD730 3.9降至2.4；而在光照有氧条件下产量极低，DCMU抑制PSII后光下厌氧培养可恢复生产，表明氧气是主要抑制因素。酶活测定显示Ter活性仍为途径瓶颈。该工作首次证实蓝细菌可从CO2自养合成1-丁醇，但产量有待提升，为后续优化提供了明确方向和靶点。
创新点
首次实现蓝细菌自养1-丁醇生产；使用Treponema denticola的Ter替代梭菌Bcd/Etf，避免铁氧还蛋白需求；发现His标签可提高Ter活性超过100倍；证明氧气是抑制1-丁醇生产的主要因素，通过黑暗厌氧或DCMU抑制PSII实现生产。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Synechococcus elongatus PCC 7942 | CoA依赖的1-丁醇合成途径 | atoB | AtoB (乙酰-CoA乙酰转移酶) | 催化 | 来自大肠杆菌，催化乙酰-CoA缩合为乙酰乙酰-CoA |
| Synechococcus elongatus PCC 7942 | CoA依赖的1-丁醇合成途径 | hbd | 3-羟基丁酰-CoA脱氢酶 | 催化 | 来自丙酮丁醇梭菌，催化乙酰乙酰-CoA还原为3-羟基丁酰-CoA |
| Synechococcus elongatus PCC 7942 | CoA依赖的1-丁醇合成途径 | crt | 巴豆酸酶 | 催化 | 来自丙酮丁醇梭菌，催化3-羟基丁酰-CoA脱水为巴豆酰-CoA |
| Synechococcus elongatus PCC 7942 | CoA依赖的1-丁醇合成途径 | T.d-ter | 反式-2-烯酰-CoA还原酶 (Ter) | 催化 | 来自齿垢密螺旋体，利用NADH还原巴豆酰-CoA为丁酰-CoA，替代梭菌Bcd/Etf复合体；His标签提高活性 |
| Synechococcus elongatus PCC 7942 | CoA依赖的1-丁醇合成途径 | adhE2 | 双功能醛/醇脱氢酶 (AdhE2) | 催化 | 来自丙酮丁醇梭菌，催化丁酰-CoA还原为丁醛并进一步还原为1-丁醇 |
关键发现
- 构建的工程菌EL14在黑暗厌氧条件下7天累积1-丁醇14.5 mg/L，细胞密度从OD730 3.9降至2.4
- His标签使Ter活性从0.0021 μmol/min/mg提高到0.444 μmol/min/mg（约100倍以上），1-丁醇产量提高约5倍
- 在5% CO2/95% N2鼓泡光照条件下仅积累2.2 mg/L 1-丁醇
- DCMU抑制PSII后，光下厌氧培养可产生1-丁醇，且产量与DCMU浓度正相关
- 各酶活测定显示Ter活性最低，是途径瓶颈。
研究结论
通过在蓝细菌中整合CoA依赖的1-丁醇合成途径，并采用His标签提高Ter活性、黑暗厌氧条件去除氧气，首次实现了从CO2和光能自养生产1-丁醇，产量达14.5 mg/L，证明该途径可行但需进一步优化。