Optimization of a heterologous mevalonate pathway through the use of variant HMG-CoA reductases

作者: Suzanne M. Ma, David E. Garcia, Alyssa M. Redding-Johanson, Gregory D. Friedland, Rossana Chan, Tanveer S. Batth, John R. Haliburton, Dylan Chivian, Jay D. Keasling, Christopher J. Petzold, Taek Soon Lee, Swapnil R. Chhabra
单位: Joint BioEnergy Institute, Emeryville, CA, United States; Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, United States; Departments of Chemical Engineering and Bioengineering, University of California, Berkeley, CA, United States; Biomass Science and Conversion Technology Department, Sandia National Laboratories, Livermore, CA, United States; Department of Chemistry, University of California, Berkeley, CA, United States
杂志: Metabolic Engineering（2011）
DOI: 10.1016/j.ymben.2011.07.001
所属领域: 代谢工程
关键词: Cofactor regenerationE. coliHMG-CoA ReductaseMetabolic pathway optimizationMevalonate kinaseMevalonate pathway
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解决的核心问题

异源甲羟戊酸途径在大肠杆菌中表达时性能不佳，主要瓶颈在于HMG-CoA还原酶步骤导致的有毒中间代谢物积累、辅因子不平衡以及下游甲羟戊酸激酶的底物抑制，从而影响最终异戊二烯产物（amorphadiene）的产量。

研究策略

通过基因组数据库筛选五种不同来源的HMG-CoA还原酶变体，进行体外动力学表征和体内蛋白表达与产物分析，选择最优变体；随后引入NADH依赖的甲酸脱氢酶并补加甲酸以再生NADH辅因子，进一步提高产物产量。

研究路线图

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核心内容

针对大肠杆菌中异源甲羟戊酸途径性能不佳的问题，该研究以HMG-CoA还原酶步骤为优化靶点，从基因组数据库筛选了五种不同来源的酶变体，通过体外动力学表征、体内蛋白表达定量及产物分析进行系统评估。结果显示，表达来自D. acidovorans的NADH依赖性HMG-CoA还原酶使amorphadiene产量较酿酒酵母天然酶提高54%，达到2.5 mM（520 mg/L）。体外实验还揭示酿酒酵母甲羟戊酸激酶存在底物抑制，约2.5 mM甲羟戊酸时反应速率最高，更高浓度下下降逾50%。在此基础上，共表达C. boidinii甲酸脱氢酶并补加50 mM甲酸以再生NADH，产量进一步总体提高120%，达到3.5 mM（700 mg/L）。该工作表明，通过单个关键酶的变体替换与辅因子工程相结合，可显著缓解中间代谢物毒性及底物抑制问题，为异源途径的系统优化提供了兼顾体外酶学与体内代谢分析的可行策略。

创新点

['利用变体HMG-CoA还原酶平衡HMG-CoA与甲羟戊酸水平，避免代谢物毒性和底物抑制；', '识别并验证了酿酒酵母甲羟戊酸激酶的底物抑制现象，为途径优化提供新视角；', '通过异源表达甲酸脱氢酶和甲酸补加策略，在保持途径其他组分不变的情况下显著提高amorphadiene产量；', '综合体外酶动力学、体内蛋白定量和产物分析，系统性地评估途径性能。']

研究对象（14）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Escherichia coli DH1	甲羟戊酸途径	atoB	乙酰乙酰辅酶A硫解酶	催化	来自E. coli，将乙酰辅酶A转化为乙酰乙酰辅酶A，合成操纵子1的第一个基因。
Escherichia coli DH1	甲羟戊酸途径	HMGS	HMG-CoA合酶	催化	来自S. cerevisiae，催化乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合生成HMG-CoA。
Escherichia coli DH1	甲羟戊酸途径	tHMGR	截短HMG-CoA还原酶	催化	来自S. cerevisiae的天然途径酶，NADPH依赖，为对照。
Escherichia coli DH1	甲羟戊酸途径	HMGR (Da)	HMG-CoA还原酶（来自Delftia acidovorans）	催化	NADH依赖，最优变体，正向速率4.87 eU/mg P，反向速率11.94 eU/mg P。
Escherichia coli DH1	甲羟戊酸途径	HMGR (Bp)	HMG-CoA还原酶（来自Bordetella petrii）	催化	NADH依赖，蛋白表达量高，但amorphadiene产量低于Da。
Escherichia coli DH1	甲羟戊酸途径	HMGR (Pm)	HMG-CoA还原酶（来自Pseudomonas mevalonii）	催化	NADH依赖，正反向反应速率接近（2.73 vs 2.70 eU/mg P）。
Escherichia coli DH1	甲羟戊酸途径	HMGR (Sa)	HMG-CoA还原酶（来自Staphylococcus aureus）	催化	NADPH依赖，正向速率最高（11.42 eU/mg P），但导致甲羟戊酸积累和MK底物抑制。
Escherichia coli DH1	甲羟戊酸途径	erg12	甲羟戊酸激酶	催化	来自S. cerevisiae，受甲羟戊酸底物抑制，最优底物浓度约2.5 mM。
Escherichia coli DH1	甲羟戊酸途径	erg8	磷酸甲羟戊酸激酶	催化	来自S. cerevisiae，合成操纵子2中的基因。
Escherichia coli DH1	甲羟戊酸途径	MVD1	磷酸甲羟戊酸脱羧酶	催化	来自S. cerevisiae，合成操纵子2中的基因。
Escherichia coli DH1	异戊二烯前体合成	idi	异戊烯基二磷酸异构酶	催化	来自E. coli，催化IPP与DMAPP互变。
Escherichia coli DH1	异戊二烯前体合成	ispA	法尼基二磷酸合酶	催化	来自E. coli，催化IPP和DMAPP缩合生成FPP。
Escherichia coli DH1	amorphadiene合成	ADS	amorphadiene合酶	催化	来自Artemisia annua，催化FPP环化生成amorphadiene。
Escherichia coli DH1	辅因子再生	fdh1	甲酸脱氢酶	能量供给	来自Candida boidinii，NAD+依赖，氧化甲酸生成CO2并产生NADH，用于增强胞内NADH水平。

关键发现

['表达来自D. acidovorans的NADH依赖性HMG-CoA还原酶使amorphadiene产量相比S. cerevisiae天然酶提高54%，达到2.5 mM（520 mg/L）48小时。', '通过共表达C. boidinii甲酸脱氢酶并补加50 mM甲酸，产量进一步总体提高120%，达到3.5 mM（700 mg/L）amorphadiene（48小时）。', '体外动力学显示S. aureus HMGR正向反应速率最高（11.42 ±
55 eU/mg P），D. acidovorans HMGR反向反应速率最高（11.94 ±
48 eU/mg P），而S. cerevisiae HMGR几乎无反向活性。', '体内甲羟戊酸产量以S. aureus HMGR最高（2.85 mM），S. cerevisiae和B. petrii相近（2.34和2.33 mM），D. acidovorans最低但amorphadiene产量最高。', '酿酒酵母甲羟戊酸激酶在约2.5 mM甲羟戊酸时反应速率最快，更高浓度导致反应速率下降超过50%，证实底物抑制。', '仅表达甲酸脱氢酶而不补加甲酸时amorphadiene产量增加7%，补加50 mM甲酸后增加44%。']

研究结论

通过单个酶（HMG-CoA还原酶）的变体替换和宿主辅因子工程，可大幅提升异源甲羟戊酸途径生产异戊二烯的效率。最佳组合（D. acidovorans HMGR + FDH + 甲酸补加）使amorphadiene产量提高120%。该策略强调了体外与体内表征结合以及辅因子管理在代谢途径优化中的重要性，为其他异源途径的改造提供了系统方法。