Three-step pathway engineering results in more incidence rate and higher emission of nerolidol and improved attraction of Diadegma semiclaesum
- 作者
- Benyamin Houshyani, Maryam Assareh, Antoni Busquets, Albert Ferrer, Harro J. Bouwmeester, Iris F. Kappers
- 单位
- Laboratory of Plant Physiology, Wageningen University; Microbiologia, Departament de Biologia, Universitat de les Illes Balears; Department of Molecular Genetics, Center for Research in Agricultural Genomics (CSIC-IRTA-UAB-UB), Campus UAB, Bellaterra (Cerdanyola del Valles) and, Departament de Bioquimica i Biologia Molecular, Facultat de Farmacia, Universitat de Barcelona; Laboratory of Entomology, Wageningen University
- 杂志
- Metabolic Engineering（2012）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2012.10.002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在拟南芥中实现 (E)-nerolidol 的稳定高效合成与释放，以增强对寄生蜂 Diadegma semiclausum 的吸引（间接防御），同时避免对植物生长的负面影响。
研究策略
在拟南芥中引入线粒体靶向的 FaNES1（CoxIV-FaNES1），并逐步共表达 FPS1L 和 HMGR1S，构建单、双、三基因工程株系，比较各株系挥发性有机物释放、植株表型及寄生蜂行为反应。
核心内容
本研究在拟南芥中系统开展三步代谢工程改造，将线粒体靶向的草莓橙花叔醇合酶FaNES1与拟南芥法尼基焦磷酸合酶FPS1L及3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR1S逐级共表达，构建单基因、双基因和三基因工程株系。结果显示，双基因和三基因株系中超过80%的植株可排放(E)-nerolidol和芳樟醇，而单基因株系仅不到50%的植株可排放；单株排放量在(E)-nerolidol 0.3–43 ng plant⁻¹ h⁻¹、芳樟醇0.3–40 ng plant⁻¹ h⁻¹之间，且两种挥发物排放量显著正相关（R=0.67）。三基因株系L和M的挥发物排放量显著高于双基因株系。行为学实验表明，纯(E)-nerolidol可吸引69.0%的寄生蜂雌蜂，未虫害的三基因株系吸引64.2%–66.4%的寄生蜂，虫害后仍保持60.7%–64.8%的吸引率。此外，通过非靶向LC-MS鉴定出7种(E)-nerolidol的非挥发性结合物，为羟基橙花叔醇的糖苷化、乙酰化和丙二酰化衍生物。该策略实现挥发物稳定高效释放并增强植物间接防御，且未观察到明显生长抑制。
创新点
1) 将线粒体靶向的 FaNES1 与 FPS1L 和 HMGR1S 共表达，显著提高 (E)-nerolidol 和芳樟醇的释放发生率和排放量；2) 三基因工程（COX++）较单/双基因工程更高效；3) 首次通过非靶向 LC-MS 鉴定 (E)-nerolidol 的非挥发性结合物（羟基橙花叔醇糖苷衍生物）；4) 行为学证明工程株系挥发物对寄生蜂具有更强吸引力。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Arabidopsis thaliana Col-3 | 萜类合成（倍半萜/单萜） | FaNES1 | 草莓(Fragaria × ananassa)橙花叔醇合酶1 | 催化 | 融合酵母CoxIV线粒体信号肽，靶向线粒体，催化FPP→(E)-nerolidol和GPP→linalool |
| Arabidopsis thaliana Col-3 | 甲羟戊酸（MVA）途径/萜类前体合成 | FPS1L | 拟南芥法尼基焦磷酸合酶1长亚型 | 催化 | 线粒体定位的FPP合酶，催化IPP与DMAPP缩合生成GPP和FPP，增加萜类前体供应 |
| Arabidopsis thaliana Col-3 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | HMGR1S | 拟南芥3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶1短亚型 | 催化 | MVA途径限速酶，催化HMG-CoA还原为甲羟戊酸，增加IPP/DMAPP前体 |
| Arabidopsis thaliana Col-3 | 蛋白定位 | — | CoxIV信号肽（酵母细胞色素氧化酶IV） | 区室化 | 将FaNES1靶向线粒体的小肽信号 |
关键发现
- 在三基因和双基因工程株系（COX+和COX++）中，超过80%的植株排放 (E)-nerolidol 和芳樟醇，而COX株系中仅不到50%的植株排放；单株排放量变化范围为 (E)-nerolidol
- 3-43 ng plant^-1 h^-1，芳樟醇
- 3-40 ng plant^-1 h^-1；(E)-nerolidol 与芳樟醇排放量显著正相关 (R=0.67, p<0.01)；纯 (E)-nerolidol 吸引69.0%的D. semiclausum雌蜂（p<0.01, n=42）；非虫害COX+植物吸引66.4%的寄生蜂（p<0.01, n=131），COX++吸引64.2%（p<0.01, n=134）；虫害后COX+吸引64.8%（p<0.05, n=71），COX++吸引60.7%（p<0.05, n=89）；COX++株系L和M的芳樟醇和(E)-nerolidol排放量显著高于COX+株系；LC-MS发现7种与转基因挥发物相关的非挥发性物质，鉴别为羟基橙花叔醇的糖苷化、乙酰化和丙二酰化衍生物。
研究结论
通过共表达线粒体靶向FaNES1、FPS1L和HMGR1S的三步代谢工程，可显著提高拟南芥(E)-nerolidol的释放发生率和排放量，并增强对寄生蜂D. semiclausum的吸引，且未观察到生长抑制与转基因产物排放之间的明确关联。该策略可用于改善植物的间接防御能力。