Establishing a platform cell factory through engineering of yeast acetyl-CoA metabolism
- 作者
- Yun Chen, Laurent Daviet, Michel Schalk, Verena Siewers, Jens Nielsen
- 单位
- Department of Chemical and Biological Engineering, Chalmers University of Technology, SE-41296 Gothenburg, Sweden; Firmenich SA, Corporate R&D Division, CH-1211 Geneva 8, Switzerland
- 杂志
- Metabolic Engineering（2012）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2012.11.002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过改造酿酒酵母的乙酰辅酶A代谢，建立能高效供给乙酰辅酶A这一通用前体代谢物的平台细胞工厂，并验证其提升目标产物（α-檀香烯）生产的能力。
研究策略
采用push-pull-block组合策略：过表达内源ADH2（受HXT7葡萄糖调控启动子控制）将乙醇回补为乙醛，过表达ALD6和来自肠炎沙门氏菌的乙酰辅酶A合成酶突变体acsE41P将乙醛转化为乙酰辅酶A（push），过表达ERG10将乙酰辅酶A拉向乙酰乙酰辅酶A（pull），并分别敲除CIT2和MLS1阻断乙醛酸循环对乙酰辅酶A的消耗（block）；同时过表达tHMG1和α-檀香烯合酶Sansyn以增强FPP和α-檀香烯合成。
核心内容
该研究以酿酒酵母CEN.PK113-11C为宿主，旨在构建能高效供给胞质乙酰辅酶A的平台细胞工厂。采用push-pull-block组合策略：在葡萄糖调控启动子控制下过表达内源ADH2将乙醇回补为乙醛，过表达ALD6及肠炎沙门氏菌来源的乙酰辅酶A合成酶突变体acsE41P强化乙酰辅酶A合成，过表达ERG10拉动乙酰辅酶A向乙酰乙酰辅酶A转化，并分别敲除乙醛酸循环中的CIT2或MLS1以减少乙酰辅酶A消耗，同时过表达tHMG1和α-檀香烯合酶以增强下游产物合成。逐步改造后，摇瓶α-檀香烯产量从参考菌株的2.08 mg/L提升至SCYc46的8.29 mg/L，为参考菌株的4倍；葡萄糖批次培养中SCYc46的产量得率达0.98 mmol/mol，较参考菌株提高3-4倍。该平台证明了组合代谢改造提升乙酰辅酶A前体供应的有效性，并具有推广至多种乙酰辅酶A衍生物生产的潜力。
创新点
首次在酿酒酵母中建立乙酰辅酶A平台细胞工厂，综合运用push-pull-block策略，包含四个基因过表达和乙醛酸循环关键基因敲除，使α-檀香烯产量提升四倍，并证明该平台可推广至多种乙酰辅酶A衍生产品。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-11C | 乙醇代谢/乙酰辅酶A合成 | ADH2 | 醇脱氢酶2 | 催化 | 在HXT7启动子控制下过表达，将乙醇氧化为乙醛 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-11C | 乙醛代谢/乙酰辅酶A合成 | ALD6 | 乙醛脱氢酶6 | 催化 | NADP依赖性，将乙醛氧化为乙酸 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-11C | 乙酰辅酶A合成 | acsE41P | 乙酰辅酶A合成酶（L641P突变体） | 催化 | 来自肠炎沙门氏菌，L641P突变避免乙酰化抑制，将乙酸转化为乙酰辅酶A |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-11C | 乙酰辅酶A转化/甲羟戊酸途径前体合成 | ERG10 | 乙酰辅酶A C-乙酰转移酶 | 催化 | 将两分子乙酰辅酶A缩合为乙酰乙酰辅酶A |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-11C | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 | 截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 催化HMG-CoA生成甲羟戊酸，解除反馈调控，增强FPP前体供应 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-11C | 萜类合成 | Sansyn | α-檀香烯合酶 | 催化 | 催化FPP生成α-檀香烯 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-11C | 乙醛酸循环 | CIT2 | 过氧化物酶体柠檬酸合酶 | 催化 | 敲除以减少过氧化物酶体中乙酰辅酶A消耗 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-11C | 乙醛酸循环 | MLS1 | 胞质苹果酸合酶 | 催化 | 敲除以减少胞质中乙酰辅酶A向C4有机酸转化 |
关键发现
- 参考菌株SCYc40在摇瓶中产生2.08 mg/L α-檀香烯
- 过表达ALD6和acsE41P的SCYc41产生2.91 mg/L
- 进一步过表达ADH2和ERG10的SCYc42产量达3.65 mg/L，比两基因策略提高25%
- 敲除CIT2的SCYc45产量达4.98 mg/L
- 敲除MLS1的SCYc46产量达8.29 mg/L，为参考菌株的4倍。在葡萄糖批次培养中，SCYc45和SCYc46的α-檀香烯得率（Ysan/glc）分别达0.87和0.98 mmol/mol，比参考菌株0.26 mmol/mol提高3-4倍
- SCYc46在乙醇阶段的α-檀香烯得率（Ysan/eth）为0.52 mmol/mol，是参考菌株0.18 mmol/mol的约2.9倍。
研究结论
成功构建了能够高效供给胞质乙酰辅酶A的平台型酿酒酵母细胞工厂，通过组合过表达ADH2、ALD6、acsE41P、ERG10并敲除CIT2或MLS1，使α-檀香烯产量较参考菌株提高四倍。该平台有望用于生产多种乙酰辅酶A衍生物，如聚羟基丁酸酯和多酮化合物等。