Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of ginsenosides
- 作者
- Zhubo Dai, Yi Liu, Xianan Zhang, Mingyu Shi, Beibei Wang, Dong Wang, Luqi Huang, Xueli Zhang
- 单位
- Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences; Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences; College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology; National Resource Center for Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences; School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University
- 杂志
- Metabolic Engineering（2013）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2013.10.004
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
人参皂苷主要依靠从人参植物中提取，产量低、周期长，化学合成因结构复杂和手性难以实现，需要开发微生物细胞工厂生产人参皂苷前体原人参二醇。
研究策略
在酿酒酵母中异源表达人参达玛烯二醇合酶（PgDDS）和原人参二醇合酶（PgPPDS）以及拟南芥NADPH-细胞色素P450还原酶（AtCPR1）；通过过表达截短HMG-CoA还原酶（tHMG1）、法尼基二磷酸合酶（ERG20）、鲨烯合酶（ERG9）和鲨烯环氧化酶（ERG1）强化甲羟戊酸途径前体供给；对PPDS进行密码子优化提高表达活性；并采用两相萃取发酵实现产物原位分离。
核心内容
研究人员在酿酒酵母BY4742中首次重构了人参皂苷前体原人参二醇的完整生物合成途径，通过异源表达人参达玛烯二醇合酶、原人参二醇合酶以及拟南芥NADPH-细胞色素P450还原酶，实现了从法尼基焦磷酸到目标产物的多步酶促转化。为突破前体供给瓶颈，研究组合过表达了截短HMG-CoA还原酶、法尼基二磷酸合酶、鲨烯合酶和鲨烯环氧化酶等甲羟戊酸途径关键基因，并对原人参二醇合酶进行密码子优化以提升其催化活性。逐步强化前体供给使初始菌株的0.05 mg/g DCW产量提升至4.49 mg/g DCW，进一步过表达鲨烯环氧化酶后产量达到8.48 mg/g DCW，密码子优化后最终菌株ZD-PPD-018的原人参二醇产量达到13.11 mg/g DCW。在补料分批发酵中，产物大量积累于黑色固体中，为克服这一问题，研究采用甲基油酸酯两相萃取发酵实现原位产物分离，最终原人参二醇产量达1189 mg/L。这项工作通过系统的代谢工程策略成功构建了高效的微生物细胞工厂，为微生物法规模化生产人参皂苷提供了可行的技术路线。
创新点
首次在酿酒酵母中重构原人参二醇生物合成途径；组合过表达多个MVA途径基因使产量大幅提升；利用两相萃取发酵有效避免黑色固体积累并显著提高产物产量。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 人参皂苷生物合成途径 | PgDDS | 达玛烯二醇合酶 | 催化 | 催化2,3-氧化鲨烯生成达玛烯二醇-II |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 人参皂苷生物合成途径 | PgPPDS | 原人参二醇合酶 | 催化 | 细胞色素P450酶，催化达玛烯二醇-II C-12位羟基化生成原人参二醇 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 人参皂苷生物合成途径 | SynPgPPDS | 密码子优化的原人参二醇合酶 | 催化 | 按酿酒酵母密码子偏好性合成，提高蛋白表达水平 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 人参皂苷生物合成途径 | AtCPR1 | NADPH-细胞色素P450还原酶 | 能量供给 | 为PPDS提供还原力，来源于拟南芥 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 | 截短的HMG-CoA还原酶 | 催化 | 去除反馈调节区域，增强MVA途径通量 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 甲羟戊酸途径 | ERG20 | 法尼基二磷酸合酶 | 催化 | 催化IPP和DMAPP缩合生成FPP |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 甲羟戊酸途径 | ERG9 | 鲨烯合酶 | 催化 | 催化两分子FPP缩合生成鲨烯 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 甲羟戊酸途径 | ERG1 | 鲨烯环氧化酶 | 催化 | 催化鲨烯生成2,3-氧化鲨烯 |
关键发现
- 初始菌株ZD-PPD-000产原人参二醇0.05 mg/g DCW
- 过表达tHMG1后ZD-PPD-010产量达4.49 mg/g DCW（89.8倍提高），达玛烯二醇-II达1.05 mg/g DCW（21倍），角鲨烯达13.78 mg/g DCW（51倍）
- 进一步过表达ERG20和ERG9（ZD-PPD-013）角鲨烯提高21%至16.68 mg/g DCW但原人参二醇无明显提高
- 再增加ERG1后（ZD-PPD-016）角鲨烯降至0.91 mg/g DCW，原人参二醇产量达8.48 mg/g DCW，达玛烯二醇-II达10.97 mg/g DCW
- 密码子优化PPDS后（ZD-PPD-018）原人参二醇提高至13.11 mg/g DCW（提高55%），达玛烯二醇-II为8.20 mg/g DCW
- 补料分批发酵中黑色固体含原人参二醇812 mg/L和达玛烯二醇-II 776 mg/L
- 采用两相萃取发酵（甲基油酸酯）最终原人参二醇产量达1189 mg/L（8.40 mg/g DCW），达玛烯二醇-II达1548 mg/L（10.94 mg/g DCW）。
研究结论
通过代谢工程将人参达玛烯二醇合酶、原人参二醇合酶及拟南芥CPR引入酿酒酵母，并强化前体供给和优化P450活性，实现了原人参二醇的高效生产，为微生物法生产人参皂苷提供了可行途径。