Elucidation and in planta reconstitution of the parthenolide biosynthetic pathway
- 作者
- Qing Liu, David Manzano, Nikola Tanić, Milica Pesic, Jasna Bankovic, Irini Pateraki, Lea Ricard, Albert Ferrer, Ric de Vos, Sander van de Krol, Harro Bouwmeester
- 单位
- Laboratory of Plant Physiology, Wageningen University; Department of Molecular Genetics, Centre for Research in Agricultural Genomics (CRAG), CSIC-IRTA-UAB-UB; Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Pharmacy, University of Barcelona; Department of Neurobiology, Institute for Biological Research "Sinis Stankovic", University of Belgrade; Department of Plant and Environmental Sciences, Faculty of Science, University of Copenhagen; Plant Research International, Wageningen; Centre for BioSystems Genomics, Wageningen; Netherlands Metabolomics Centre, Leiden
- 杂志
- Metabolic Engineering（2014）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2014.03.005
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
小白菊内酯（parthenolide）是药用植物短舌匹菊中的主要活性成分，具有抗癌潜力，但其生物合成途径尚未完全阐明，尤其是催化木香烃内酯环氧化生成小白菊内酯的合酶基因未知，限制了其在异源系统中的生产及应用。
研究策略
结合454测序构建短舌匹菊腺毛cDNA文库，通过序列同源性搜索和共表达分析筛选候选基因，在酵母中进行功能表征，再在烟草（Nicotiana benthamiana）中瞬时共表达全部途径基因实现小白菊内酯生物合成途径的重构，并通过添加拟南芥HMG-CoA还原酶增强前体供应。
核心内容
该研究通过454测序构建短舌匹菊腺毛cDNA文库，结合同源性搜索和共表达分析筛选候选基因，在酵母中功能表征后，于烟草中瞬时共表达全部途径基因，完整阐明了小白菊内酯的生物合成途径。研究首次鉴定了催化木香烃内酯环氧化生成小白菊内酯的合酶基因TpPTS（CYP71CA1），并额外发现一个3β-羟化酶CYP71CB1，可催化木香烃内酯和小白菊内酯生成极性更强的3β-羟基衍生物。在烟草中共表达TpGAS、TpGAO和TpCOS时木香烃内酯产量为9.6±0.8 μg/g鲜重，添加拟南芥HMG-CoA还原酶后产量提高4倍；进一步加入TpPTS后检测到游离小白菊内酯2.05 ng/g鲜重，而半胱氨酸和谷胱甘肽结合物分别达1368.4和87.5 ng/g鲜重。共表达CYP71CB1后约40%的木香烃内酯结合物被转化。活性测试显示小白菊内酯结合物对结肠癌细胞HT-29的IC50分别为17.3 μM和10.7 μM，而游离小白菊内酯对敏感结肠癌DLD1的IC50为2.1 μM。该研究为通过代谢工程在异源宿主中规模化生产小白菊内酯及其水溶性衍生物奠定了基础。
创新点
首次鉴定了小白菊内酯合酶（TpPTS，CYP71CA1）基因，并完整阐明了小白菊内酯生物合成途径；在烟草中成功重构了完整途径，并发现产物主要以半胱氨酸和谷胱甘肽结合物形式存在；额外鉴定了一个木香烃内酯/小白菊内酯3β-羟化酶（CYP71CB1），可产生极性更强的衍生物；发现小白菊内酯结合物对结肠癌细胞具有选择性抗癌活性。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母（WAT11） | 小白菊内酯生物合成途径 | TpGAS | (+)-germacrene A synthase | 催化 | 催化FDP生成germacrene A，先前已报道 |
| 酿酒酵母（WAT11） | 小白菊内酯生物合成途径 | TpGAO | germacrene A oxidase (CYP71 family) | 催化 | 催化germacrene A氧化为germacra-1(10),4,11(13)-trien-12-oic acid |
| 酿酒酵母（WAT11） | 小白菊内酯生物合成途径 | TpCOS | costunolide synthase | 催化 | 催化germacra-1(10),4,11(13)-trien-12-oic acid转化为木香烃内酯 |
| 酿酒酵母（WAT11） | 小白菊内酯生物合成途径 | TpPTS (Tp2116, CYP71CA1) | parthenolide synthase | 催化 | 催化木香烃内酯C4-C5双键环氧化生成小白菊内酯 |
| 酿酒酵母（WAT11） | 小白菊内酯生物合成途径侧枝 | Tp8878 (CYP71CB1) | costunolide/parthenolide 3β-hydroxylase | 催化 | 催化木香烃内酯和/or小白菊内酯羟基化生成3β-羟基衍生物 |
| 烟草（Nicotiana benthamiana） | 甲羟戊酸途径（前体供给） | AtHMR (AtHMGR) | HMG-CoA reductase | 催化 | 拟南芥可溶性HMG-CoA还原酶，增强FDP前体供应，使木香烃内酯产量提高4倍 |
| 烟草（Nicotiana benthamiana） | 小白菊内酯生物合成途径 | TpGAS, TpGAO, TpCOS, TpPTS, Tp8878 | 对应编码酶（GAS, GAO, COS, PTS, 3β-hydroxylase） | 催化 | 通过农杆菌瞬时共表达重构完整途径，检测到小白菊内酯及其半胱氨酸/谷胱甘肽结合物 |
关键发现
- 从短舌匹菊中分离并鉴定了TpGAO、TpCOS、TpPTS（CYP71CA1）和Tp8878（CYP71CB1）等基因
- 酵母微粒体实验证实TpPTS催化木香烃内酯生成小白菊内酯，Tp8878催化木香烃内酯和小白菊内酯分别生成3β-羟基木香烃内酯和3β-羟基小白菊内酯
- 在烟草中瞬时共表达TpGAS+TpGAO+TpCOS时木香烃内酯产量为9.6±0.8 μg/g FW（n=8）
- 共表达AtHMGR后木香烃内酯产量提高4倍
- 加入TpPTS和AtHMGR后检测到游离小白菊内酯2.05 ng/g FW，同时半胱氨酸结合物为1368.4 ng/g FW、谷胱甘肽结合物为87.5 ng/g FW
- 共表达Tp8878后约40%的木香烃内酯结合物被转化，小白菊内酯结合物减少71%
- 抗癌活性测试显示小白菊内酯-半胱氨酸和谷胱甘肽结合物对结肠癌细胞HT-29的IC50分别为17.3 μM和10.7 μM，而游离小白菊内酯对敏感结肠癌DLD1的IC50为2.1 μM，对HT-TxR为1.8 μM。
研究结论
通过基因挖掘和功能表征，完整阐明了小白菊内酯的生物合成途径，并在烟草中成功重构。产生的半胱氨酸和谷胱甘肽结合物具有较好水溶性且对结肠癌细胞有选择性活性。该研究为通过代谢工程在异源宿主中规模化生产小白菊内酯及其水溶性衍生物奠定了基础，有助于抗癌药物开发。