高级醇 · 代谢工程文献库

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Metabolic engineering of monoterpene biosynthesis in tomato fruits via introduction of the non-canonical substrate neryl diphosphate

作者
Michael Gutensohn, Thuong T.H. Nguyen, Richard D. McMahon III, Ian Kaplan, Eran Pichersky, Natalia Dudareva
单位
Department of Horticulture and Landscape Architecture, Purdue University; Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan; Department of Entomology, Purdue University; Department of Biochemistry, Purdue University
杂志
Metabolic Engineering（2014）
DOI
10.1016/j.ymben.2014.05.008
所属领域
代谢工程
关键词
CarotenoidsDirect plant defenseGeranylgeranyl diphosphate synthaseMonoterpenesNeryl diphosphateTomato
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解决的核心问题

番茄果实中是否天然存在非经典底物NPP，以及如何通过代谢工程在果实中利用NPP合成单萜产物，并探讨其对类胡萝卜素代谢和植物防御的影响。

研究策略

在番茄果实中利用果实特异性PG启动子过表达单萜合酶PHS1、NPP合酶NDPS1以及GPP合酶小亚基GPPS-SSU，通过单基因过表达和共表达策略，引入非经典底物NPP，实现NPP依赖的单萜生物合成，并分析代谢通量分流与反馈抑制。

研究路线图

100%
研究问题：番茄果实中是否存在NPP底物，能否利用NPP合成单萜？
策略：果实特异性启动子PG驱动单/多基因过表达引入NPP
单基因过表达：PHS1（仅GPP产物）
单基因过表达：NDPS1（生成NPP）
关键发现1：果实内源无NPP池
关键发现2：NPP抑制GGPPS（I50≈25μM）→番茄红素↓
策略优化：PHS1×NDPS1共表达（NPP被消耗）
结果：NPP衍生单萜混合物（β-水芹烯等）；番茄红素恢复至76.29；橙花醇降低89%-97%
结论：NPP必须被消耗利用；NPP衍生单萜增强果实直接防御（抗虫、抗真菌）
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核心内容

该研究以番茄果实为对象，探讨非经典单萜前体橙花基二磷酸（NPP）在果实代谢工程中的应用潜力。作者利用果实特异性PG启动子，在番茄中分别或共表达水芹烯合酶PHS1、NPP合酶NDPS1以及来自金鱼草的GPP合酶小亚基GPPS-SSU。结果表明，单独表达PHS1仅产生微量由GPP衍生的月桂烯和罗勒烯，证明果肉中不存在天然NPP池；而表达NDPS1可在果实中生成NPP并产生橙花醇（最高达20 nmol/g FW），但番茄红素含量下降13.9%至88.7%。体外实验证实NPP可竞争性抑制GGPPS活性（I50约25 μM）。当PHS1与NDPS1共表达时，NPP被单萜合酶消耗，产生含β-水芹烯和2-蒈烯的NPP衍生单萜混合物，番茄红素水平恢复至76.29±12.61 nmol/g FW，橙花醇降低89%至97%。功能分析显示，共表达果实使棉铃虫幼虫体重增长减少45%，灰霉菌生长受抑55%。该研究首次阐明番茄果实中NPP合成与消耗的代谢权衡，证明通过引入非经典底物并耦合下游合酶，可在不损伤类胡萝卜素积累的前提下重构果实萜类代谢，并增强果实对生物胁迫的天然防御能力。

创新点

首次证明番茄果实果肉中不存在天然NPP池；通过表达NDPS1在果实中生成NPP，但发现NPP可作为GGPPS抑制剂导致番茄红素降低；共表达PHS1消耗NPP后，番茄红素水平得到恢复，且产生的单萜混合物具有直接的抗虫和抗真菌活性。

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
番茄（Solanum lycopersicum）果实 单萜生物合成 PHS1 水芹烯合酶1（Phellandrene synthase 1） 催化 以NPP为偏好底物，也可利用GPP，分别生成不同的单萜产物。
番茄（Solanum lycopersicum）果实 单萜前体合成（NPP形成） NDPS1 橙花基二磷酸合酶1（Neryl diphosphate synthase 1） 催化 催化IPP和DMAPP缩合形成cis构型的NPP。
番茄（Solanum lycopersicum）果实 单萜前体合成（GPP形成） GPPS-SSU（来自金鱼草） 牻牛儿基二磷酸合酶小亚基（Geranyl diphosphate synthase small subunit） 调控 与内源GGPPS大亚基互作，改变链长特异性以增加GPP池。
番茄（Solanum lycopersicum）果实 类胡萝卜素生物合成 Sl-GGPPS-2 牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶（GGPPS） 催化 类胡萝卜素合成途径关键分支酶，被NPP抑制（I50约25 μM）。

关键发现

  1. PHS1单独过表达仅产生少量来源于GPP的月桂烯和罗勒烯，表明果实中无内源NPP
  2. NDPS1过表达使番茄红素含量降低13.9%-88.7%，并产生橙花醇（最高达20 nmol/g FW）
  3. NPP体外抑制GGPPS活性，I50约为25 μM，且竞争性抑制DMAPP
  4. PHS1×NDPS1共表达产生包含β-水芹烯和2-蒈烯等NPP衍生的单萜混合物，番茄红素恢复至76.29±12.61 nmol/g FW（与NDPS1 A11的31.92±2.07相比），橙花醇水平降低89%-97%
  5. 共表达果实使棉铃虫幼虫体重增加减少45%，灰霉菌生长减少55%。

研究结论

通过在番茄果实中表达NDPS1可产生NPP，但NPP必须被单萜合酶如PHS1消耗，以避免对GGPPS的抑制和类胡萝卜素合成的负面影响；NPP衍生的单萜混合物能增强果实对食草动物和病原真菌的直接防御能力。