Precise precursor rebalancing for isoprenoids production by fine control of gapA expression in Escherichia coli
- 作者
- Juyoung Jung, Jae Hyung Lim, Se Yeon Kim, Dae-Kyun Im, Joo Yeon Seok, Seung-Jae V. Lee, Min-Kyu Oh, Gyoo Yeol Jung
- 单位
- Department of Life Sciences, Pohang University of Science and Technology, 77 Cheongam-ro, Nam-gu, Pohang, Gyeongbuk 37673, Korea; Department of Chemical Engineering, Pohang University of Science and Technology, 77 Cheongam-ro, Nam-gu, Pohang, Gyeongbuk 37673, Korea; School of Interdisciplinary Bioscience and Bioengineering, Pohang University of Science and Technology, 77 Cheongam-ro, Nam-gu, Pohang, Gyeongbuk 37673, Korea; Department of Chemical and Biological Engineering, Korea University, 145 Anam-ro, Seongbuk-gu, Seoul 02841, Korea
- 杂志
- Metabolic Engineering（2017）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2016.10.003
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
在E. coli中通过DXP途径生物合成异戊二烯类化合物时，前体甘油醛-3-磷酸（G3P）与丙酮酸（PYR）供给不平衡，限制了碳流导向目标产物，需精细调控前体比例。
研究策略
以番茄红素合成为模型，首先利用合成启动子和重新设计的5'-UTR扩增内源DXP途径和异源合成途径，然后对ppsA和gapA进行转录/翻译水平的精细表达调控，筛选最优前体平衡状态。
核心内容
该研究以大肠杆菌W3110为底盘，针对DXP途径合成异戊二烯类化合物时前体甘油醛-3-磷酸（G3P）与丙酮酸供给失衡的问题，以番茄红素为模型产物开展前体精准再平衡。作者首先利用合成启动子和重新设计的5'-UTR对DXP途径及异源合成途径进行模块化扩增，使番茄红素产量从基础菌株的1.81 mg/g DCW逐步提升至7.84 mg/g DCW；随后在转录和翻译水平对ppsA与gapA进行精细调控。结果表明，过表达ppsA的最优菌株产量为9.90 mg/g DCW，进一步过表达反而降至8.99 mg/g DCW；而下调gapA的最优菌株产量达14.34 mg/g DCW，较亲本提高97%，比最优ppsA变体高45%。代谢物分析显示，下调gapA使（DHAP+G3P）/PYR比值较亲本提高约20倍，且该比值与产量变化强相关。研究首次证实gapA是前体平衡的最佳工程靶点，直接增加G3P池比强化丙酮酸回补更有效，该策略可推广至其他异戊二烯类高值化合物的生产。
创新点
首次提出并证实gapA是前体平衡的最佳工程靶点；通过下调gapA而非过表达ppsA直接增加G3P池，更有效地提高异戊二烯产量；利用合成启动子和5'-UTR变体库实现对ppsA/gapA的定量精细调控。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli W3110 | 糖酵解 / 类异戊二烯前体途径 | gapA | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) | 催化 | 下调表达（合成启动子+合成5'-UTR变体），直接增加G3P池；最优菌株JYJ11产量14.34 mg/g DCW，较亲本提高97% |
| Escherichia coli W3110 | 糖异生 / 类异戊二烯前体途径 | ppsA | 磷酸烯醇式丙酮酸合酶 (PpsA) | 催化 | 过表达间接增加G3P池；最优菌株JYJ8 (V4)产量9.90 mg/g DCW，较亲本提高37% |
| Escherichia coli W3110 | DXP途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 (DXS) | 催化 | 过表达扩增DXP途径限速步骤，菌株JYJ3产量7.84 mg/g DCW |
| Escherichia coli W3110 | DXP途径 | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 (IDI) | 催化 | 过表达使IPP/DMAPP异构化，菌株JYJ2较JYJ1提高88% |
| Escherichia coli W3110 | DXP途径 / 类异戊二烯途径 | ispA | 法尼基二磷酸合酶 (IspA) | 催化 | 过表达合成FPP，菌株JYJ1产量3.29 mg/g DCW，较JYJ0提高81% |
| Escherichia coli W3110 | 异源番茄红素合成途径 | crtE | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 (CrtE) | 催化 | 来自Pantoea agglomerans，催化GGPP合成 |
| Escherichia coli W3110 | 异源番茄红素合成途径 | crtB | 八氢番茄红素合酶 (CrtB) | 催化 | 来自Pantoea agglomerans，催化两分子GGPP缩合 |
| Escherichia coli W3110 | 异源番茄红素合成途径 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 (CrtI) | 催化 | 来自Pantoea agglomerans，脱氢生成番茄红素 |
关键发现
- DXP途径扩增使番茄红素产量逐步提升：JYJ0 (crtEBI)为1.81 mg/g DCW
- JYJ1 (+ispA)为3.29 mg/g DCW，提高81%
- JYJ2 (+idi)为6.20 mg/g DCW，较JYJ1提高88%
- JYJ3 (+dxs)为7.84 mg/g DCW，较JYJ0提高332%。前体平衡调控中，最优ppsA过表达菌株JYJ8 (V4)产量为9.90 mg/g DCW，较亲本提高37%
- 过度表达降至8.99 mg/g DCW。最优gapA下调菌株JYJ11产量达14.34 mg/g DCW，较亲本提高97%，且比最优ppsA变体高45%。代谢物分析显示，gapA下调使(DHAP+G3P)/PYR比值较亲本提高约20倍，其中JYJ11的比值达化学计量需求的3倍，与番茄红素产量变化强相关。
研究结论
前体平衡是异戊二烯生物合成的关键步骤。在葡萄糖最小培养基中，下调gapA直接增加G3P池，比过表达ppsA更有效地提高番茄红素产量，gapA可作为前体平衡的工程靶点。该策略可广泛应用于代谢工程和合成生物学中高值异戊二烯类化合物的生产。