Carotenoid analysis of sweetpotato Ipomoea batatas and functional identification of its lycopene β- and ε-cyclase genes
- 作者
- Muhammad Zubair Khan, Miho Takemura, Takashi Maoka, Motoyasu Otani, Norihiko Misawa
- 杂志
- Zeitschrift für Naturforschung C（2016）
- DOI
- 10.1515/znc-2016-0150
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析甘薯（Ipomoea batatas）品种WS和W71的类胡萝卜素组成，并克隆和功能鉴定其番茄红素β-和ε-环化酶基因。
研究策略
对甘薯叶片和块茎进行类胡萝卜素HPLC-MS分析；通过RT-PCR和RACE从叶片克隆环化酶基因；将基因导入产番茄红素的大肠杆菌进行异源表达，通过HPLC分析酶产物；通过实时荧光定量PCR分析基因表达水平。
核心内容
该研究对甘薯品种WS和W71的类胡萝卜素组成进行了系统分析，并克隆鉴定了其番茄红素环化酶基因的功能。通过HPLC-MS检测发现，两品种叶片总类胡萝卜素含量分别为34和170 μg/g鲜重，以叶黄素和β-胡萝卜素为主；块茎含量较低（0.5和4.0 μg/g鲜重），但含有罕见的5,6-环氧-β环或5,8-环氧-β环类胡萝卜素，如WS块茎中β-胡萝卜素-5,8,5',8'-二环氧化物占25.1%。研究从两品种中克隆了五个番茄红素β-环化酶基因（IbLCYb1-5）和一个ε-环化酶基因（IbLCYe），并导入产番茄红素的大肠杆菌进行异源表达。功能验证表明IbLCYb1-4能将番茄红素转化为β-胡萝卜素，而IbLCYb5无活性；IbLCYe是严格的ε-单环化酶，仅生成δ-胡萝卜素，与IbLCYb1或IbLCYb2共表达时可合成α-胡萝卜素。表达分析显示环化酶基因在叶片中高表达。这些结果揭示了甘薯块茎中独特环氧化类胡萝卜素的积累机制，并为通过代谢工程调控甘薯类胡萝卜素组成提供了关键酶基因资源。
创新点
首次对甘薯品种WS和W71的类胡萝卜素进行全面分析，发现块茎中含有罕见的5,6-环氧-β环或5,8-环氧-β环类胡萝卜素；从两个品种中分离了多个番茄红素β-环化酶基因（IbLCYb1-5）和一个番茄红素ε-环化酶基因（IbLCYe），并通过功能互补验证了其活性；发现IbLCYe是严格的ε-单环化酶，只能将一个ε环加到番茄红素上生成δ-胡萝卜素。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Ipomoea batatas (甘薯) 品种WS和W71 | 类胡萝卜素生物合成 | IbLCYb1, IbLCYb2, IbLCYb3, IbLCYb4, IbLCYb5 | 番茄红素β-环化酶 | 催化 | IbLCYb1-4具有功能，IbLCYb5无功能 |
| Ipomoea batatas (甘薯) 品种WS和W71 | 类胡萝卜素生物合成 | IbLCYe | 番茄红素ε-环化酶 | 催化 | ε-单环化酶，可将番茄红素转化为δ-胡萝卜素 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源类胡萝卜素合成 | crtE, crtB, crtI (来自Pantoea ananatis) | GGPP合成酶、八氢番茄红素合成酶和八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 用于构建产番茄红素大肠杆菌 |
关键发现
- 甘薯叶片总类胡萝卜素含量：WS叶为34 μg/g FW，W71叶为170 μg/g FW
- 块茎中WS为0.5 μg/g FW，W71为4.0 μg/g FW。叶片中以lutein（约43-47%）和β-胡萝卜素（约31%）为主。块茎中检测到独特类胡萝卜素：WS块茎中β-胡萝卜素-5,8-环氧化物占9.4%，β-胡萝卜素-5,6,5',8'-二环氧化物占35.7%，β-胡萝卜素-5,8,5',8'-二环氧化物占25.1%
- W71块茎中相应为4.6%、9.2%和13.8%。WS块茎含ipomoeaxanthin A（4.5%），W71块茎含β-隐黄质-5',6'-环氧化物（2.2%）。功能鉴定表明IbLCYb1-4能在大肠杆菌中将番茄红素转化为β-胡萝卜素，而IbLCYb5无功能
- IbLCYe能将番茄红素转化为δ-胡萝卜素
- IbLCYb1或IbLCYb2与IbLCYe共表达可产生α-胡萝卜素。表达分析显示IbLCYb和IbLCYe在叶片中高表达，块茎中IbLCYb转录水平远高于IbLCYe。
研究结论
甘薯块茎含有罕见的带5,6-环氧-β环或5,8-环氧-β环的类胡萝卜素；克隆的IbLCYb1-4和IbLCYe基因分别编码有功能的番茄红素β-环化酶和ε-环化酶（单环化酶），其中IbLCYb1/2与IbLCYe共同作用可合成α-胡萝卜素。