Efficient phototrophic production of a high-value sesquiterpenoid from the eukaryotic microalga Chlamydomonas reinhardtii
- 作者
- Kyle J. Lauersen, Thomas Baier, Julian Wichmann, Robin Wordenweber, Jan H. Mussgnug, Wolfgang Hübner, Thomas Huser, Olaf Kruse
- 单位
- Bielefeld University, Faculty of Biology, Centre for Biotechnology (CeBiTec); Biomolecular Photonics, Department of Physics, Bielefeld University
- 杂志
- Metabolic Engineering（2017）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2016.07.013
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
真核微藻莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中异源生产高价值倍半萜类化合物的能力尚未被证实，且其光合驱动代谢工程的潜力需要探索。
研究策略
将广藿香醇合酶（PcPs）密码子优化后通过核转基因在莱茵衣藻胞质中表达，利用荧光蛋白融合筛选高表达株；采用基因融合、多拷贝串联（基因加载）策略提高酶蛋白含量；并比较不同碳源（CO2、乙酸）对倍半萜产量的影响。
核心内容
该研究首次在真核微藻莱茵衣藻中实现了高价值倍半萜广藿香醇的异源光合生产。研究者将密码子优化的广藿香醇合酶（PcPs）通过核转基因在胞质中表达，采用多拷贝串联基因融合策略构建了223.9 kDa的三拷贝PcPs-YFP融合蛋白，并利用十二烷两相培养实现产物原位捕获。结果显示，45 mL摇瓶培养中最高产量达922 μg/g CDW；400 mL批次培养中以CO₂和乙酸混合为碳源时产量最高，达435 μg/L，而完全光自养条件下总倍半萜产量估计为1.03 mg/L。将大肠杆菌FPP合酶ispA与PcPs融合使相对产量提高约2.2倍，双表达PcPs-YFP与PcPs-CFP的菌株产量达877 μg/g CDW。所有工程菌株的光系统II效率与野生型无显著差异。该工作证实莱茵衣藻具备可利用的胞质FPP库，倍半萜合酶蛋白量是当前产量限制因素，碳源类型显著影响FPP代谢流分配，证明莱茵衣藻可作为光合驱动的倍半萜生产平台。
创新点
首次在真核微藻中实现异源倍半萜类化合物的光合生产；开发了PcPs多拷贝串联融合蛋白表达策略，获得223.9 kDa的异源蛋白（3XPCs-YFP），为目前莱茵衣藻中表达的最大异源蛋白；利用dodecane两相培养实现产物原位捕获；揭示了碳源对FPP代谢流的影响。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Chlamydomonas reinhardtii UVM4 | 萜类生物合成（MEP途径） | PcPs | 广藿香醇合酶（Pogostemon cablin patchoulol synthase, Q49SP3） | 催化 | 异源表达于胞质，催化FPP环化生成广藿香醇 |
| Chlamydomonas reinhardtii UVM4 | 萜类前体合成 | CrFPPs | 法尼基焦磷酸合酶（A8IX41） | 催化 | 天然FPP合酶，定位于细胞核周围ER区域 |
| Chlamydomonas reinhardtii UVM4 | 萜类前体合成 | ispA | 大肠杆菌法尼基焦磷酸合酶（P22939） | 催化 | 与PcPs融合表达，提高底物通道效率 |
| Chlamydomonas reinhardtii UVM4 | 萜类前体合成 | ERG20 | 酿酒酵母法尼基焦磷酸合酶（P08524） | 催化 | 单独可表达，与PcPs融合时未获得全长蛋白 |
| Chlamydomonas reinhardtii UVM4 | 萜类生物合成 | 3XPCs-YFP | 三拷贝串联广藿香醇合酶与YFP融合蛋白 | 催化 | 223.9 kDa，C. reinhardtii中最大异源蛋白，显著提高产量 |
| Chlamydomonas reinhardtii UVM4 | 亚细胞靶向 | PsaD/AtpA | 叶绿体/线粒体靶向肽 | 区室化 | 用于探测亚细胞FPP池，但靶向表达未检测到广藿香醇产物 |
关键发现
- 在45 mL TAP摇瓶培养中，3XPCs-YFP菌株广藿香醇产量最高达922±242 μg/g CDW（6天）
- 400 mL批次培养中，以CO2为碳源时广藿香醇产量为351±6 μg/L，乙酸为363±41 μg/L，CO2+乙酸为435±25 μg/L
- 估算完全光自养条件下总倍半萜产量达1.03 mg/L。单位生物量产量分别为：CO2 279±15 μg/g CDW，乙酸520±72 μg/g CDW，混合309±14 μg/g CDW。ispA-PcPs融合使相对产量提高约2.2倍
- 双表达PcPs-YFP+PcPs-CFP产量达877±153 μg/g CDW。3XPCs菌株的Fv/Fm为0.807±0.001，与野生型0.802±0.001无显著差异，光系统II效率未受影响。
研究结论
莱茵衣藻具有可利用的胞质FPP库，倍半萜合酶蛋白量是当前产量限制因素，通过多拷贝基因融合可显著提高产量。碳源影响FPP流向：乙酸条件下单位生物量产量更高，而CO2条件下体积产率稳步增加。该研究证明莱茵衣藻可作为光合驱动倍半萜生产的底盘平台。