Engineering Escherichia coli for selective 1-decanol production using the reverse β-oxidation (rBOX) pathway
- 作者
- Jing Chen, Ramon Gonzalez
- 单位
- Department of Chemical, Biological, and Materials Engineering, University of South Florida, Tampa, FL, USA
- 杂志
- Metabolic Engineering（2023）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2023.07.006
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
利用反向β-氧化（rBOX）途径选择性生产1-癸醇，解决因核心酶和终止酶对不同链长酰基-CoA的混杂活性而导致的产物链长混合问题。
研究策略
选取具有重叠链长特异性的rBOX核心酶（BktB、FadB、tdTER）和终止酶（Maqu2507），通过优化酶表达、增强NADH供给、敲除硫酯酶yigI减少副产物，并结合正十二烷双相发酵原位萃取产物，在不同培养基和反应器条件下提高1-癸醇的产量、得率和纯度。
核心内容
该研究通过在大肠杆菌中构建反向β-氧化（rBOX）途径，实现了1-癸醇的高选择性合成。核心策略是将具有重叠链长特异性的rBOX核心酶（BktB、FadB、TdTER）与双功能脂肪酰基-CoA还原酶Maqu2507作为终止酶组合，使癸酰-CoA优先转化为1-癸醇。通过将tdTER置于独立T7启动子下提高表达，初始菌株CJ065的1-癸醇产量从700 mg/L提升至1350 mg/L；敲除硫酯酶yigI减少癸酸副产物30%；缺失pflB并过表达aceEF增强NADH供给后，菌株CJ118产量增加40%至1900 mg/L。结合15%正十二烷双相发酵原位萃取，产量较无有机相提高2.5倍。最终，CJ118在富培养基中产生6.1 g/L 1-癸醇（特异性91%），无机盐培养基中达2.8 g/L且特异性100%，在500 mL生物反应器中72小时产量达10.05 g/L，为迄今报道的最高滴度。研究表明，终止酶链长选择性与底盘代谢优化的组合是提升脂肪醇生产选择性和滴度的有效途径，该菌株具备工业开发潜力。
创新点
['首次利用rBOX途径实现1-癸醇的高选择性合成', '筛选出双功能脂肪酰基-CoA还原酶Maqu2507作为终止酶，使1-癸醇成为主要产物', '通过缺失硫酯酶YigI减少癸酸副产物，提高1-癸醇纯度', '结合pflB敲除与aceEF过表达增强NADH供给，显著提高产物滴度', '采用正十二烷双相发酵策略降低产物毒性和提高转运，产量提升2.5倍', '在无机盐培养基中实现100%的1-癸醇特异性，且单位细胞产量高于富培养基']
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JST07 | — | — | — | 调控 | 混合酸发酵和硫酯酶缺陷菌株，减少副产物和乙酰-CoA水解，用于筛选终止酶和rBOX表达。 |
| Escherichia coli JST07 | reverse β-oxidation (rBOX) | — | — | 催化 | 核心碳链延伸循环，通过非脱羧Claisen缩合高效延长碳链。 |
| Escherichia coli JST07 | reverse β-oxidation (rBOX) | bktB | BktB | 催化 | 源自Ralstonia eutropha的3-酮脂酰-CoA硫解酶，催化初始引物和链延伸的缩合反应，具有宽链长特异性。 |
| Escherichia coli JST07 | reverse β-oxidation (rBOX) | fadB | FadB | 催化 | 源自E. coli的多功能酶，具有3-羟基酰基-CoA脱氢酶和3-羟基酰基-CoA脱水酶活性，催化第一轮还原和水合脱水。 |
| Escherichia coli JST07 | reverse β-oxidation (rBOX) | tdTER | TdTER | 催化 | 源自Treponema denticola的反式-烯酰-CoA还原酶，催化第二轮还原，是循环中不可逆步骤。 |
| Escherichia coli JST07 | reverse β-oxidation (rBOX) | maqu_2507 | Maqu2507 | 催化 | 源自Marinobacter aquaeolei的双功能脂肪酰基-CoA还原酶（ACR），催化脂肪酰-CoA经醛还原为脂肪醇，对decanoyl-CoA特异性较高。 |
| Escherichia coli JST07 | reverse β-oxidation (rBOX) | yigI | YigI | 催化 | 硫酯酶，负责水解癸酰-CoA产生癸酸副产物；在CJ091中敲除，使癸酸减少30%。 |
| Escherichia coli JST07 | pyruvate metabolism | pflB | PflB | 催化 | 丙酮酸甲酸裂解酶，敲除使丙酮酸流向PDH产生NADH；缺失后与aceEF过表达协同提高1-癸醇产量40%。 |
| Escherichia coli JST07 | pyruvate metabolism | aceE, aceF | PDH (E1/E2 subunits) | 能量供给 | 丙酮酸脱氢酶复合物亚基，过表达以增加NADH供给，满足1-癸醇合成对还原力的需求（每分子1-癸醇需8 NADH和2 NADPH）。 |
关键发现
['初始菌株CJ064（Maqu2507）产生约700 mg/L 1-癸醇，占总C6-C12醇酸产物的约60%。', '将tdTER置于独立T7启动子下提高其表达后，菌株CJ065的1-癸醇产量从700 mg/L提高到1350 mg/L（2倍）。', '敲除硫酯酶基因yigI使癸酸副产物减少30%，1-癸醇滴度提高10%（菌株CJ091）。', '缺失pflB并过表达aceEF（菌株CJ118）使1-癸醇滴度增加40%，达到1900 mg/L。', '在15% v/v正十二烷覆盖的双相发酵中，CJ118产生4.4 g/L 1-癸醇（36 h，产率0.21 g/g）和4.7 g/L（48 h，产率0.20 g/g），较无有机相提高2.5倍。', '优化诱导剂浓度和工作体积后，富培养基中1-癸醇产量达6.1 g/L（0.26 g/g产率），特异性91%（C6-C12醇酸中1-癸醇占91%）。', '无机盐培养基中，CJ118产生2.8 g/L 1-癸醇（0.14 g/g产率），特异性100%，无C6-C12副产物，单位细胞产量为992 mg/gDCW，比富培养基高30%。', '在500 mL生物反应器中，CJ118在72小时内产生10.05 g/L 1-癸醇，产率0.2 g/g，为迄今报道的最高滴度。', '上述滴度、产率和纯度均比文献报道高至少10倍。']
研究结论
本研究证明，将rBOX途径与合适链长特异性的终止酶组合，结合底盘工程优化，能够高效选择性生产1-癸醇。最优菌株CJ118在富培养基、无机盐培养基及生物反应器中分别达到6.1 g/L、2.8 g/L和10.05 g/L的产量，且纯度最高达100%，展示了工业应用潜力。