Development of Corynebacterium glutamicum as a monoterpene production platform
- 作者
- Bridget A. Luckie, Meera Kashyap, Allison N. Pearson, Yan Chen, Yuzhong Liu, Luis E. Valencia, Alexander Carrillo Romero, Graham A. Hudson, Xavier B. Tao, Bryan Wu, Christopher J. Petzold, Jay D. Keasling
- 单位
- Joint BioEnergy Institute, 5885 Hollis Street, Emeryville, CA, 94608, USA; Biological Systems & Engineering Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, 94720, USA; Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley, CA, 94720, USA; Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, CA, 94720, USA; Institute for Quantitative Biosciences, University of California, Berkeley, CA, 94720, USA; Joint Program in Bioengineering, University of California, Berkeley, San Francisco, CA, 94720, USA; Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California, Berkeley, CA, 94720, USA; The Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technical University of Denmark, Denmark; Center for Synthetic Biochemistry, Institute for Synthetic Biology, Shenzhen Institutes for Advanced Technologies, Shenzhen, China
- 杂志
- Metabolic Engineering（2024）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2023.11.009
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在工业安全微生物谷氨酸棒杆菌中开发高效单萜生产平台，克服此前单萜产量低（≤15 mg/L）的问题，并解析香叶醇还原为香茅醇的代谢机制。
研究策略
异源表达甲羟戊酸（MVA）途径提供前体，通过优化质粒骨架、启动子、GPP合酶来源，敲除竞争性香叶基香叶基焦磷酸合酶基因（crtE和idsA）以增强前体通量，并采用角鲨烷有机覆盖层构建双相培养系统减少产物挥发；通过同位素标记和蛋白组学解析香叶醇代谢途径。
核心内容
本研究在工业安全菌株谷氨酸棒杆菌中构建了高效单萜生产平台。通过异源表达甲羟戊酸（MVA）途径为单萜合成提供充足前体，系统优化质粒骨架、启动子及香叶基焦磷酸（GPP）合酶来源，并敲除竞争性香叶基香叶基焦磷酸合酶基因crtE和idsA以增强前体通量，同时引入角鲨烷有机覆盖层构建双相培养系统以减少产物挥发损失。经系列改造后，异戊烯醇产量达1504.6 mg/L，较原始质粒提高1.38倍，为谷氨酸棒杆菌中迄今最高值；单萜产物中1,8-桉叶素产量达723.6 mg/L，芳樟醇为227.8 mg/L，香叶醇类产物为321.1 mg/L，显著超越了此前报道的≤15 mg/L水平。通过同位素标记实验与蛋白组学分析，研究阐明了香叶醇经柠檬醛中间体不对称还原为香茅醇的代谢路径，并发现AdhC具有无环单萜醛还原活性，过表达后产物中橙花醇和香茅醇各占约40%。这一平台的成功建立不仅实现了谷氨酸棒杆菌中迄今最高的单萜产量，也为利用该安全宿主生产其他萜类化合物奠定了技术基础。
创新点
首次在谷氨酸棒杆菌中实现基于MVA途径的单萜平台，获得迄今最高单萜产量（1,8-桉叶素723.6 mg/L）；发现角鲨烷作为有效有机覆盖层；阐明香叶醇经柠檬醛中间体不对称还原为香茅醇的机制，并发现AdhC具有无环单萜醛还原活性。
研究对象（21）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Corynebacterium glutamicum | MVA途径（异源） | atoB | 乙酰辅酶A乙酰转移酶 | 催化 | 异源MVA途径起始酶，催化乙酰辅酶A缩合 |
| Corynebacterium glutamicum | MVA途径（异源） | HMGS | 羟甲基戊二酰辅酶A合酶 | 催化 | 催化HMG-CoA生成 |
| Corynebacterium glutamicum | MVA途径（异源） | HMGR | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 来自S. pomeroyi，催化HMG-CoA还原为甲羟戊酸 |
| Corynebacterium glutamicum | MVA途径（异源） | MK | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 催化甲羟戊酸磷酸化 |
| Corynebacterium glutamicum | MVA途径（异源） | PMK (ERG8) | 磷酸甲羟戊酸激酶 | 催化 | 来自S. cerevisiae，催化磷酸甲羟戊酸磷酸化 |
| Corynebacterium glutamicum | MVA途径（异源） | PMD | 二磷酸甲羟戊酸脱羧酶 | 催化 | 催化二磷酸甲羟戊酸脱羧生成IPP |
| Corynebacterium glutamicum | MVA途径（异源） | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 来自E. coli，催化IPP与DMAPP互变 |
| Corynebacterium glutamicum | 单萜生物合成 | ERG20WW | 香叶基二磷酸合酶（突变体） | 催化 | 来自S. cerevisiae，催化IPP和DMAPP缩合生成GPP |
| Corynebacterium glutamicum | 单萜生物合成 | AgGPPS | 香叶基二磷酸合酶 | 催化 | 来自Abies grandis（截短型AgGPP52），比ERG20WW更高效 |
| Corynebacterium glutamicum | 单萜生物合成 | ObGEScP | 香叶醇合酶 | 催化 | 来自Ocimum basilicum，催化GPP生成香叶醇 |
| Corynebacterium glutamicum | 单萜生物合成 | CinSco | 1,8-桉叶素合酶 | 催化 | 来自Streptomyces clavuligeris，催化GPP生成1,8-桉叶素 |
| Corynebacterium glutamicum | 单萜生物合成 | LinSco | 芳樟醇合酶 | 催化 | 来自Streptomyces clavuligeris，催化GPP生成芳樟醇 |
| Corynebacterium glutamicum | 类胡萝卜素合成（竞争途径） | crtE | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 内源GGPP合酶，竞争IPP/DMAPP，敲除以增加单萜前体 |
| Corynebacterium glutamicum | 类胡萝卜素合成（竞争途径） | idsA | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 内源GGPP合酶，竞争IPP/DMAPP，敲除以增加单萜前体 |
| Corynebacterium glutamicum | 中心碳代谢 | poxB | 丙酮酸脱氢酶 | 催化 | 敲除以减少副产物乙酸，增加乙酰辅酶A供应 |
| Corynebacterium glutamicum | 中心碳代谢 | ldhA | 乳酸脱氢酶 | 催化 | 敲除以减少乳酸副产物，增加乙酰辅酶A供应 |
| Corynebacterium glutamicum | 醛还原/醇代谢 | adhC | 乙醛还原酶（FudC） | 催化 | 内源醛还原酶，对无环单萜醛具有底物宽泛性，缺失导致香茅醛积累 |
| Corynebacterium glutamicum | 醇代谢 | adhA | 醇脱氢酶 | 催化 | 内源醇脱氢酶，其缺失对香叶醇还原无影响 |
| Corynebacterium glutamicum | 烯还原途径 | Cgl3088 | 2,4-二烯酰辅酶A还原酶（OYE同源） | 催化 | 推测的Old Yellow Enzyme，敲除后不影响香叶醇还原 |
| Corynebacterium glutamicum | 烯还原途径 | Cgl3092 | 2,4-二烯酰辅酶A还原酶（OYE同源） | 催化 | 推测的Old Yellow Enzyme，敲除后不影响香叶醇还原 |
| Corynebacterium glutamicum | 醛氧化途径 | Cgl2844 | 推测的酰基辅酶A还原酶/NAD依赖醛脱氢酶 | 催化 | 柠檬醛响应蛋白，敲除后不影响柠檬醛氧化，实际功能未知 |
关键发现
- 通过质粒优化使异戊烯醇产量达1504.6 mg/L（C. glutamicum中最高）；在敲除crtE和idsA的菌株中，香叶醇类产物达321.1 mg/L，1,8-桉叶素达723.6 mg/L，芳樟醇达227.8 mg/L；异戊烯醇产量较原始质粒提高1.38倍（1504.64 vs
- 58 mg/L）；使用AgGPPS使香叶醇类产量提高1.39倍（40.56 vs
- 08 mg/L）；敲除crtE和idsA后产量提高2倍（98.22 mg/L）；最大生产率分别为13.63 mg/L/h（PLCI-218）、18.81 mg/L/h（PLCI-230）和5.95 mg/L/h（PLCI-231）；同位素标记证明D1-香茅醇为主要产物，证实醛中间体途径；AdhC过表达后产物中香叶醇约23%、橙花醇和香茅醇各约40%。
研究结论
本研究成功开发了谷氨酸棒杆菌作为单萜生产平台，利用异源MVA途径和双相培养技术实现了迄今最高单萜产量（>700 mg/L），为其他萜类生产奠定了基础。同时揭示AdhC参与单萜醛还原，但香叶醇还原为香茅醇的完整酶系仍需进一步研究。