Integrated analysis of isopentenyl pyrophosphate (IPP) toxicity in isoprenoid-producing Escherichia coli
- 作者
- Kevin W. George, Mitchell Thompson, Joonhoon Kim, Edward E.K. Baidoo, George Wang, Veronica Teixeira Benites, Christopher J. Petzold, Leanne Jade G. Chan, Suzan Yilmaz, Petri Turhanen, Paul D. Adams, Jay D. Keasling, Taek Soon Lee
- 单位
- Joint BioEnergy Institute; Biological Systems & Engineering Division, Lawrence Berkeley National Laboratory; Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley; Chemical and Biological Processes Development Group, Pacific Northwest National Laboratory; School of Pharmacy, Biocenter Kuopio, University of Eastern Finland; Molecular Biophysics and Integrated Bioimaging Division, Lawrence Berkeley National Laboratory; Department of Bioengineering, University of California, Berkeley; Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California, Berkeley; The Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technical University of Denmark
- 杂志
- Metabolic Engineering（2018）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2018.03.004
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
异戊烯基焦磷酸（IPP）积累对大肠杆菌宿主具有毒性，但其毒性机制和系统影响尚不清楚，限制了类异戊二烯的高效生产。
研究策略
构建三菌株实验平台（野生型、平衡产异戊烯醇的3A菌株、过量表达MK导致IPP积累的3Amk菌株），结合代谢组学、蛋白质组学、转录组学等多组学分析，系统评估IPP积累对宿主生理、代谢和基因表达的影响。
核心内容
该研究构建了野生型、平衡产异戊烯醇的3A菌株及过量表达甲羟戊酸激酶导致IPP积累的3Amk菌株，结合代谢组学、蛋白质组学和转录组学系统解析了IPP积累对大肠杆菌宿主的毒性机制。结果显示，3Amk菌株胞内IPP峰值浓度约370 mM，远高于3A菌株的40 mM，对应异戊烯醇产量仅180 mg/L而3A达约600 mg/L。IPP积累引发多重毒性效应：PMK蛋白水平在诱导后6–18小时下降8倍导致MVA通路断裂，ATP从5.2 mM骤降至0.8 mM，葡萄糖摄取完全停止，死亡细胞比例超过10%，质粒稳定性及CFU下降约40%。研究发现IPP可被大肠杆菌摄取并形成异戊烯基-ATP类似物ApppI，其含量较3A高约10倍且与ATP水平呈反相关，可能是毒性关键介质。该工作首次系统阐明了IPP毒性的分子机制，表明缓解IPP毒性或设计IPP旁路是提高类异戊二烯产量的重要方向。
创新点
首次综合多组学手段系统解析IPP毒性的生理和分子机制；发现IPP可被大肠杆菌摄取；发现IPP积累导致异戊烯基-ATP类似物ApppI的形成，可能为毒性关键介质。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH1 | — | — | — | — | 宿主菌株，携带空白载体或异戊烯醇合成途径质粒 |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | mvaS | HMGS (3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase) | 催化 | 来源于金黄色葡萄球菌，催化乙酰辅酶A缩合生成HMG-CoA |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | mvaA | HMGR (3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase) | 催化 | 来源于金黄色葡萄球菌，催化HMG-CoA还原为甲羟戊酸 |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | — | MK (mevalonate kinase) | 催化 | 来源于酿酒酵母，3Amk菌株额外表达约10倍MK蛋白，导致IPP积累 |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | — | PMK (phosphomevalonate kinase) | 催化 | 来源于酿酒酵母，在3Amk菌株中蛋白水平在6-18小时下降8倍，导致通路断裂 |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | — | PMD (mevalonate pyrophosphate decarboxylase) | 催化 | 来源于酿酒酵母，可催化甲羟戊酸磷酸脱羧形成IP，参与IPP旁路 |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | nudB | NudB (Nudix hydrolase) | 催化 | 来源于大肠杆菌，催化IPP脱磷酸形成IP，或水解其他核苷二磷酸 |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | atoB | AtoB (acetyl-CoA acetyltransferase) | 催化 | 来源于大肠杆菌，催化乙酰辅酶A缩合为乙酰乙酰辅酶A |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | — | 未鉴定的IPP转运蛋白（推测） | 转运 | 实验中观察到大肠杆菌对IPP的摄取/外排现象，具体转运体尚未确认 |
关键发现
- 3Amk菌株胞内IPP峰值浓度约370 mM，而3A菌株约40 mM，IPP毒性阈值约在40-250 mM之间
- 3Amk异戊烯醇产量仅180 mg/L，3A约600 mg/L
- 3Amk中PMK蛋白水平在诱导后6-18小时下降8倍，导致MVA通路“断裂”
- 3Amk中ATP水平从诱导前5.2 mM降至3小时0.8 mM，腺苷酸能荷降低
- 3Amk中死亡细胞比例超过10%，而3A小于1%
- 3Amk质粒不稳定，选择性平板上CFU降低约40%
- IPP积累导致葡萄糖摄取在诱导后1-6小时完全停止
- IPP积累导致ApppI（m/z 574）形成，3Amk中峰面积约比3A高10倍，且与ATP水平反相关
- 次级培养的3Amk菌株不再积累IPP和异戊烯醇。
研究结论
IPP积累对大肠杆菌产生多层面的毒性效应，包括生长抑制、细胞活力下降、质粒不稳定、代谢“暂停”、ATP耗竭及核苷酸代谢扰动，并可能通过形成ApppI类似物介导毒性。缓解IPP毒性或绕过IPP（如IPP旁路）是提高类异戊二烯产量的关键策略。