Evolution-guided tolerance engineering of Pseudomonas putida KT2440 for production of the aviation fuel precursor isoprenol
- 作者
- Hyun Gyu Lim, Aparajitha Srinivasan, Russel Menchavez, Ian S. Yunus, Myung Hyun Noh, Megan White, Yan Chen, Jennifer W. Gin, Bernhard O. Palsson, Taek Soon Lee, Christopher J. Petzold, Thomas Eng, Aindrila Mukhopadhyay, Adam M. Feist
- 单位
- Department of Bioengineering, University of California San Diego; Joint BioEnergy Institute; Department of Biological Sciences and Bioengineering, Inha University; Biological Systems and Engineering Division, Lawrence Berkeley National Laboratory; Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technical University of Denmark; Environmental Genomics and Systems Biology Division, Lawrence Berkeley National Laboratory
- 杂志
- Metabolic Engineering（2025）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2025.05.007
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
异戊烯醇（3-甲基-3-丁烯-1-醇）是航空燃料前体，但其对底盘菌株Pseudomonas putida KT2440的毒性限制了产量、速率和得率，需要提高菌株对异戊烯醇的耐受性以实现高效生产。
研究策略
采用耐受性适应实验室进化（TALE）对野生型和两个缺失已知异戊烯醇分解/转运功能的菌株进行平行进化，结合全基因组重测序和宏蛋白质组分析鉴定耐受性关键突变，并通过反向工程和蛋白质组学指导的理性工程（如删除fleQ）恢复生产性能。
研究路线图
核心内容
本研究针对异戊烯醇对恶臭假单胞菌KT2440的产物毒性限制，采用耐受性适应实验室进化策略，对野生型及缺失已知分解/转运功能基因的菌株进行平行进化，结合全基因组重测序与宏蛋白质组分析鉴定关键耐受突变。进化菌株在8 g/L异戊烯醇下可稳健生长（最高比生长速率约0.20–0.25 h⁻¹），而起始菌株无法生长；在4 g/L条件下平均生长速率提升1.8倍，滞后时间由约1小时降至几乎为零。通过收敛突变分析发现多个新耐受位点（如gnuR、PP_3024等），反向工程证实ΔPP_3024突变使6 g/L下生长速率提高1.7倍。针对耐受性与生产之间的权衡，蛋白质组学指导的fleQ基因删除有效恢复进化克隆的异戊烯醇产量和消耗至起始水平。该工作建立了进化与理性工程相结合的底盘开发策略，为航空燃料前体的微生物高效生产提供了可行方案。
创新点
1. 对多个遗传背景菌株进行系统性TALE进化，获得能在8 g/L异戊烯醇下生长的菌株；2. 通过收敛突变分析发现多个新的耐受性相关基因位点（如gnuR、PP_3024等）；3. 蛋白质组学指导的fleQ删除有效缓解了耐受性与生产之间的权衡；4. 建立了进化与理性工程相结合的鲁棒底盘开发策略。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas putida KT2440 | 异戊烯醇分解代谢途径 | PP_2675 | PQQ cofactor regeneration enzyme | 催化 | 敲除后阻断异戊烯醇降解，菌株不能以异戊烯醇为唯一碳源 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 异戊烯醇分解代谢途径 | PP_4064-PP_4067 (ivd-mccB-liuC-mccA) | Ivd, MccB, LiuC, MccA | 催化 | 参与异戊烯醇分解为乙酰辅酶A，缺失使菌株丧失异戊烯醇生长能力 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 短链醇代谢 | PP_3839 | — | 催化 | 对短链醇有已知活性，但单独敲除无异戊烯醇适应性缺陷 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 异戊烯醇外排 | tggB (PP_1385) | TgB | 转运 | 来自P. putida DOTT1E的推定异戊烯醇外排泵同源物，起始菌株IPL400中敲除 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 多药外排系统 | ttgB (TtgABC系统组分) | TtgB | 转运 | 进化中WT/IPL300背景发生大片段缺失导致失活，提高异戊烯醇耐受性 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 全局应激调控 | gnuR (PP_3415) | GnuR | 调控 | LacI家族转录抑制因子，在所有IPL300/IPL400进化谱系中100%突变，WT谱系后期出现；失活有利于异戊烯醇耐受 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 未知/应激适应 | PP_3024 | — | 调控 | 假设蛋白，功能未知；ΔPP_3024使6 g/L异戊烯醇下生长速率提高1.7倍，是PP_3024-PP_5558大缺失的主要贡献者 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 鞭毛合成 | fleQ | FleQ | 调控 | 鞭毛主调控因子；蛋白质组学指导删除可恢复进化菌株的异戊烯醇产量和消耗，缓解耐受-生产权衡 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 双组分系统/乙酸代谢 | mxtR (PP_1695, crbS) | MxtR (CrbS) | 调控 | 传感器激酶，与ErdR组成双组分系统；突变多为单氨基酸替换，抑制乙酸代谢基因的不必要激活 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 双组分系统/乙酸代谢 | erdR (PP_1635, crbR) | ErdR (CrbR) | 调控 | 响应调节子，与MxtR组成双组分系统；在ALE11/12中出现156-bp缺失或氨基酸替换 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 芳香酸分解/转运 | pcaK-opdH区域（含ttgABC、PP_1395等） | — | 转运 | 该大区域在11/12个终点分离株中突变，含外排泵和调控因子；ttgB失活与耐受性提高相关，但反向工程ΔttgB-PP_1395完全消除异戊烯醇生产 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 噬菌体/前噬菌体区域 | PP_3024-PP_5558 | — | 区室化 | 50%终点分离株发生40,784 bp大缺失，包含53个噬菌体/焦虫相关基因；缺失可能消除不利基因表达，提高耐受 |
关键发现
- 进化菌株在8 g/L异戊烯醇下可稳健生长（最高比生长速率约0.2~0.25 h^-1），而起始菌株无法生长。在4 g/L异戊烯醇下，所有进化分离株的平均生长速率提高1.8倍（约0.50 h^-1），滞后时间从约1小时降至几乎为零。TALE实验经历约143-353代，累计细胞分裂数达1.33×10^12至3.32×10^12。共鉴定出158个独特突变，分布于73个遗传区域
- 12个独立进化谱系中有12个基因座发生收敛突变。反向工程证实ΔPP_3024突变在6 g/L异戊烯醇下使生长速率提高1.7倍，ΔPP_3024-PP_5558区域缺失也类似
- ΔttgB-PP_1395完全消除异戊烯醇生产。通过删除fleQ，进化克隆的异戊烯醇产量和消耗恢复至起始菌株水平。蛋白质组学显示两个进化菌株分别有约120和110个蛋白差异表达，占总检测蛋白的约5%。
研究结论
通过整合实验室进化和理性工程策略，成功开发了耐受异戊烯醇的Pseudomonas putida KT2440底盘菌株，克服了产物毒性限制，为可持续航空燃料前体的微生物生产提供了有效方法。