Beyond CEN.PK - parallel engineering of selected S. cerevisiae strains reveals that superior chassis strains require different engineering approaches for limonene production
- 作者
- Yanmei Zhu, Sasha Yogiswara, Anke Willekens, Agathe Gerardin, Rob Lavigne, Alain Goossens, Vitor B. Pinheiro, Zongjie Dai, Kevin J. Verstrepen
- 单位
- VIB - KU Leuven Center for Microbiology, Gaston Gemelaan 1, 3001, Leuven, Belgium; CMPG Laboratory of Genetics and Genomics, Department M2S, KU Leuven, Gaston Gemelaan 1, 3001, Leuven, Belgium; Laboratory of Gene Technology, KU Leuven, Kasteelpark Arenberg 21 box 2462, Heverlee, 3001, Leuven, Belgium; Department of Plant Biotechnology and Bioinformatics, Ghent University, B-9052 Ghent, Belgium; VIB Center for Plant Systems Biology, B-9052 Ghent, Belgium; Department of Botany and Zoology, Stellenbosch University, Private Bag X1, Matieland, 7600, South Africa; KU Leuven, Rega Institute for Medical Research, Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, Herestraat, 49 - box 1041, 3000, Leuven, Belgium; Key Laboratory of Engineering Biology for Low-carbon Manufacturing, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin, 300308, China
- 杂志
- Metabolic Engineering（2025）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2025.04.011
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
目前微生物细胞工厂研究通常局限于少数模式菌株（如CEN.PK2-1C），这些菌株并非针对特定工业过程进行优化，导致目标产物产量偏低。本研究旨在利用酿酒酵母种内遗传多样性，筛选更优底盘菌株用于柠檬烯生产，并探究不同底盘菌株是否需要定制化的代谢工程策略。
研究策略
高通量筛选921株酿酒酵母的柠檬烯耐受性和脂质含量，选出5个底盘菌株（CEN.PK2-1C、Y119、Y243、Y488、Y891）；评估16种植物柠檬烯合酶，确定CltLS1为最优合酶；对不同底盘菌株进行并行基因工程（引入CltLS1、tHMG1、ERG20突变体），再模块化改造MVA途径（上/下游模块），并结合LC-MS代谢组学分析菌株间MVA通量差异，最终采用菌株特异性策略提高产量。
研究路线图
核心内容
本研究突破了传统代谢工程对模式菌株CEN.PK的依赖，系统利用酿酒酵母种内遗传多样性筛选柠檬烯生产底盘。作者高通量评估了921株野生酿酒酵母的柠檬烯耐受性，发现仅46%的菌株能在300 mM柠檬烯浓度下存活，且常用模式菌株CEN.PK2-1C、S288C、W303均无法生长，而Y119和Y243表现出显著耐受优势。在酶筛选中鉴定出柠檬烯合酶CltLS1为最优催化剂，并针对5个代表性底盘菌株进行平行基因工程，包括引入CltLS1、tHMG1及ERG20突变体，再模块化改造MVA通路上、下游模块。结果揭示工程策略具有明显菌株特异性：野生菌Y488通过过表达上游模块获益，而Y243更适合下游模块强化。代谢组学分析表明，Y243野生型菌株的GPP和FPP水平分别是CEN.PK2-1C的2.4倍和18.6倍，具有天然MVA通量优势。最终通过定制化策略，新菌株Y243产量达844 mg/L，较CEN.PK2-1C的605 mg/L提高40%。该研究表明，扩大底盘菌株筛选范围并结合菌株特异性工程策略，可突破模式菌株的性能瓶颈，为高效生产萜类化合物提供了新思路。
创新点
['首次系统利用酿酒酵母种内多样性筛选柠檬烯生产底盘菌株，突破模式菌株局限', '发现最佳工程策略具有菌株特异性，不存在‘一刀切’方案', '鉴定出柠檬烯合酶CltLS1在酿酒酵母中表现最佳，并验证了4个新合酶在Y243中的功能', '通过代谢组学揭示不同菌株MVA途径的天然瓶颈差异（如Y243内源MVA流量更高）', '获得新菌株Y243，产量达844 mg/L，较常用底盘CEN.PK2-1C提高40%']
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae (Y243) | 甲羟戊酸途径 / 柠檬烯生物合成 | CltLS1 | 柠檬烯合酶（来自 Citrus limon） | 催化 | 最优柠檬烯合酶，在Y243中产量最高，用于最终工程菌株 |
| Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK2-1C, Y119, Y243, Y488, Y891) | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 | 截短的HMG-CoA还原酶 | 催化 | 过表达可提升CEN.PK2-1C产量2.8倍，但对Y243反而降低30% |
| Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK2-1C, Y119, Y243, Y488, Y891) | 甲羟戊酸途径 / 单萜前体供给 | ERG20 (ERG20^F96W-N127W) | 法尼基焦磷酸合酶突变体（增强GPP积累） | 催化 | 突变体促进GPP供应，显著提升所有菌株柠檬烯产量，Y243中提高6.3倍 |
| Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK2-1C, Y243, Y488) | 甲羟戊酸途径上游模块 | ERG10, ERG13, tHMG1 | 乙酰辅酶A硫解酶、HMG-CoA合酶、截短HMG-CoA还原酶 | 催化 | 过表达仅对Y488有明显促进（约2.5倍），对其他菌株无显著效果 |
| Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK2-1C, Y243, Y488) | 甲羟戊酸途径上游模块（细菌来源） | EfmvaE, EfmvaS | 来自粪肠球菌的乙酰辅酶A硫解酶/HMG-CoA还原酶与HMG-CoA合酶 | 催化 | 细菌上游模块与天然模块效果类似，但MVA积累更高 |
| Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK2-1C, Y243, Y488) | 甲羟戊酸途径下游模块 | ERG12, ERG8, ERG19, IDI1 | 甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、IPP:DMAPP异构酶 | 催化 | 过表达下游模块对Y243提升最大（350%），最终Y243^ABCF达141.6 mg/L |
| Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK2-1C, Y243, Y488) | 甲羟戊酸途径下游模块 | ERG12, IDI1 | 甲羟戊酸激酶、IPP:DMAPP异构酶 | 催化 | 进一步过表达这两个基因，促进MVA下游转化，对Y243和CEN.PK2-1C有1.6倍和3.8倍提升 |
| Saccharomyces cerevisiae (Y243, CEN.PK2-1C) | 柠檬烯生物合成 | CltLS1-linker-ERG20 (A*) | CltLS1与ERG20的翻译融合蛋白 | 催化 | 通过AG4TGGA linker融合，增加合酶积累，但仅在部分菌株中有效 |
关键发现
- 在300 mM柠檬烯筛选浓度下，921株酿酒酵母中仅431株（46%）生长OD600>1.0，模式菌株CEN.PK2-1C、S288C、W303均无法生长
- 在1000 mM下仅Y119和Y243能生长。表达CltLS1后，Y243的柠檬烯产量较CEN.PK2-1C高6.9倍以上，其中ArtLS时达23.7倍
- 仅表达CltLS1时Y243^A产量为3.7 mg/L，而CEN.PK2-1C^A仅0.5 mg/L。引入ERG20^F96W-N127W后Y243^AC达26.9 mg/L（较单合酶提高6.3倍），最终Y243^ABC为31.2 mg/L，Y488^ABC为23.9 mg/L，CEN.PK2-1C^ABC仅5.4 mg/L。模块化MVA工程中，过表达上游模块仅使Y488^ABCD/E提升约2.5倍至约70 mg/L（为CEN.PK2-1C^ABCD/E的14倍）
- 过表达下游模块使Y243^ABCF达141.6 mg/L（为CEN.PK2-1C^ABCF 21.5 mg/L的6.6倍）。完整MVA途径过表达后，Y488^ABCEF达197.8 mg/L，Y243^ABCEF为185.4 mg/L，CEN.PK2-1C^ABCD为75.2 mg/L。进一步过表达ERG12和IDI1及引入CltLS1-ERG20融合蛋白后，Y243^ABCEFG和CEN.PK2-1C^ABCEFG分别提升1.6倍和3.8倍，而Y488^ABCEF则下降0.8/0.7倍。最终通过菌株特异性策略实现新菌株844 mg/L的产量，较CEN.PK2-1C的605 mg/L高40%。代谢组学显示，Y243野生型GPP和FPP分别是CEN.PK2-1C的2.4倍和18.6倍，且MVA水平更高。
研究结论
酿酒酵母种内遗传多样性为柠檬烯生产提供了性能显著优于模式菌株的底盘菌株，但最佳工程策略因菌株而异。菌株Y243凭借其天然的MVA通量优势成为优良底盘，通过定制化途径工程可实现高产。研究强调了在代谢工程中扩大底盘菌株筛选范围并匹配特异性策略的重要性。