A Genetic Selection For Neurospora crassa Mutants Altered in Their Light Regulation of Transcription
- 作者
- Laura Navarro-Sampedro, Charles Yanofsky, Luis M. Corrochano
- 单位
- Departamento de Genética, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla, Sevilla, Spain; Department of Biological Sciences, Stanford University, Stanford, California 94305
- 杂志
- Genetics（2008）
- DOI
- 10.1534/genetics.107.079582
- 所属领域
- 微生物遗传学
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定参与粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）光适应（photoadaptation）的调控基因，即长期光照下光激活转录受抑制的机制。
研究策略
利用con-10启动子驱动潮霉素抗性基因hph的翻译融合报告系统，通过UV诱变筛选在持续光照下能耐受潮霉素的突变体，并分析突变体的光响应基因表达和类胡萝卜素积累。
核心内容
本研究在粗糙脉孢菌中建立了一种基于潮霉素抗性的遗传筛选方法，以鉴定参与光适应（即长期光照抑制光激活转录）的调控基因。作者将con-10启动子与潮霉素抗性基因hph融合，经UV诱变后在持续光照下筛选耐潮霉素突变体，共获得SN1–SN5五个菌株。其中SN2、SN4和SN5在持续光照下con-10::hph及内源con-10、con-6 mRNA均持续高表达至少5小时，表明光适应抑制机制受损；而vivid和wc-1的光诱导不受影响，提示调控具有基因特异性。这些突变体中al-1、al-2、al-3 mRNA在光照30分钟时较对照增加2–3倍，但5小时后多回落；光照1天后类胡萝卜素积累较野生型高约3倍。突变体的光激活阈值和WC-1磷酸化模式未见明显改变。结果表明光适应存在基因特异性的转录抑制机制，鉴定这些突变基因将有助于揭示真菌光调控转录的新蛋白与调控通路。
创新点
首次建立基于潮霉素抗性筛选光适应突变体的遗传筛选方法，分离了5个耐潮霉素突变体，发现光适应存在基因特异性调控，且与已知的vivid基因无关。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Neurospora crassa | 光信号传导 | wc-1 | WC-1 | 调控 | 蓝光受体和锌指转录因子，与WC-2形成白领复合物（WCC）激活光诱导基因 |
| Neurospora crassa | 光信号传导 | wc-2 | WC-2 | 调控 | 锌指转录因子，与WC-1互作形成WCC |
| Neurospora crassa | 光适应 | vvd | VIVID | 调控 | 含黄素结合域的光适应光受体，负调控光反应 |
| Neurospora crassa | 光调控转录/分生孢子发育 | con-10 | CON-10 | 调控 | 功能未知，受光诱导表达并表现光适应，作为报告基因用于筛选 |
| Neurospora crassa | 光调控转录/分生孢子发育 | con-6 | CON-6 | 调控 | 分生孢子相关基因，受光诱导并表现光适应，与con-10类似 |
| Neurospora crassa | 类胡萝卜素生物合成 | al-1 | AL-1 | 催化 | 参与类胡萝卜素生物合成，光诱导表达 |
| Neurospora crassa | 类胡萝卜素生物合成 | al-2 | AL-2 | 催化 | 八氢番茄红素合酶，光诱导表达 |
| Neurospora crassa | 类胡萝卜素生物合成 | al-3 | AL-3 | 催化 | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶，光诱导表达 |
| Neurospora crassa | 筛选标记 | hph | 潮霉素磷酸转移酶 | 催化 | 赋予潮霉素抗性，被con-10调控区驱动作为报告基因 |
关键发现
- 分离到5个耐潮霉素突变体（SN1-SN5）。其中SN2、SN4、SN5在持续光照下con-10::hph和内生con-10 mRNA高表达并持续至少5小时，表明光适应抑制机制受损
- con-6 mRNA也呈现类似持续高表达。而SN2、SN4、SN5中vivid和wc-1的光诱导不受影响，说明调控具有基因特异性。在SN2、SN4、SN5中，al-1、al-2、al-3 mRNA在光照30分钟时比CHZ10增加2-3倍，但光照5小时后多数回落（SN4的al-2除外）。光照1天后，除SN1外，各突变体类胡萝卜素积累比野生型或CHZ10高约3倍，而vivid突变体高约5倍。光激活阈值在突变体与野生型中均为约10^2 J/m^2。突变体的光依赖WC-1磷酸化模式无明显改变。
研究结论
本研究所分离的突变体可能破坏了光适应中抑制转录的机制，且光适应调控是基因特异性的。鉴定这些突变基因有望揭示真菌光调控基因转录的新蛋白和机制。