高级醇 · 代谢工程文献库

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Towards acetone-uncoupled biofuels production in solventogenic Clostridium through reducing power conservation

作者
Dong Liu, Zhengjiao Yang, Ping Wang, Huanqing Niu, Wei Zhuang, Yong Chen, Jinglan Wu, Chenjie Zhu, Hanjie Ying, Pingkai Ouyang
单位
State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University; Jiangsu National Synergetic Innovation Center for Advance Material (SICAM); State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, Biomedical Nanotechnology Center, East China University of Science and Technology
杂志
Metabolic Engineering（2018）
DOI
10.1016/j.ymben.2018.03.012
所属领域
代谢工程
关键词
2,3-butanediolClostridium acetobutylicumNADHatom economybiobutanolredox cofactor
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解决的核心问题

溶剂性梭菌丁醇发酵中丙酮作为副产物导致底物转化率低、原子经济性差，而传统通过操作溶剂生成基因消除丙酮的策略效果有限；核心问题是细胞内还原力（NADH）的流失，而非丙酮生成基因本身。

研究策略

在丙酮丁醇梭菌中引入人工合成的2,3-丁二醇合成途径作为NADH补偿模块，通过系统层面重新平衡还原力，从而在不操作溶剂生成基因的前提下选择性消除丙酮并提高总醇产率。

研究路线图

100%
研究问题：丁醇发酵中还原力流失导致丙酮副产物及低产率
策略：引入2,3-丁二醇合成途径作为NADH补偿模块
关键改造1：异源表达alsD_bsu+bdhA_bsu，引入RBS优化
关键改造2：补充acr_cbe同工酶，完全转化乙偶姻
关键改造3：获得工程菌DH2，丙酮消除至<0.3 g/L
系统效应：H₂降78%、通量重排、蛋白组重塑
结果：总醇产率0.44 g/g，总溶剂22.8 g/L（迄今最高）
结论：丙酮受还原力驱动，NADH补偿模块实现无丙酮高醇生产
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核心内容

该研究提出一种不依赖溶剂生成基因操作的策略来解决丙酮丁醇梭菌发酵中丙酮副产物问题。作者在Clostridium acetobutylicum B3中引入人工合成的2,3-丁二醇合成途径作为NADH补偿模块，通过系统层面重新平衡细胞内还原力。工程菌DH2中丙酮被消除至0.3 g/L以下，氢气释放降低78%，总醇产率提高19%至0.44 g/g葡萄糖，为当时报道的丁醇发酵最高值，2,3-丁二醇最高产量达7.9 g/L，总溶剂产量达22.8 g/L。代谢通量分析显示丙酮通量减少94%，蛋白质组学揭示Adc表达降低3至5倍，CtfAB降低30至1000倍，AdhE1下调而AdhE2和电子传递黄素蛋白EtfAB-Fcd上调。该工作证实丙酮形成本质上由还原力不足驱动而非溶剂生成基因直接作用，通过强化还原力供给可在无pH控制条件下彻底消除丙酮并显著提高溶剂产率，为梭菌氧化还原工程提供了新方向。

创新点

首次基于2,3-丁二醇生物合成构建NADH补偿模块；无需改动溶剂生成基因即可彻底消除丙酮（<0.3 g/L）；通过引入RBS和双2,3-丁二醇脱氢酶同工酶组合实现高产物滴度；首次实现无pH控制条件下丙酮的工业相关消除，并获得迄今最高溶剂产率。

研究对象（15）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Clostridium acetobutylicum B3 丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵 — — 能量供给 野生型生产菌株，用于构建NADH补偿模块
Clostridium acetobutylicum B3 2,3-丁二醇合成 alsD AlsD（α-乙酰乳酸脱羧酶） 催化 C. acetobutylicum自身alsD过表达使乙偶姻由1.6 g/L提高至5.0 g/L，是乙偶姻生产的关键基因
Clostridium acetobutylicum B3 2,3-丁二醇合成 alsD_bsu AlsD（来源于枯草芽孢杆菌） 催化 异源表达使乙偶姻提高281%至6.1 g/L，丙酮降低61%至1.9 g/L
Clostridium acetobutylicum B3 2,3-丁二醇合成 bdhA_bsu BdhA（2,3-丁二醇脱氢酶，来源于枯草芽孢杆菌） 催化 与alsD_bsu共表达并引入RBS后，2,3-丁二醇产量达7.9 g/L
Clostridium acetobutylicum B3 2,3-丁二醇合成 acr_cbe Acr（2,3-丁二醇脱氢酶，来源于拜氏梭菌） 催化 与bdhA_bsu互补，完全转化乙偶姻，最终菌株DH2中2,3-丁二醇为7.2 g/L
Clostridium acetobutylicum B3 2,3-丁二醇合成 alsS AlsS（α-乙酰乳酸合酶） 催化 过表达有毒性，导致生长迟缓和丁醇产量下降，不适用于本策略
Clostridium acetobutylicum B3 2,3-丁二醇合成 alsR AlsR（转录调控因子） 调控 在C. acetobutylicum中敲除或过表达对乙偶姻产量无明显影响
Clostridium acetobutylicum B3 丙酮生成 adc Adc（乙酰乙酸脱羧酶） 催化 在DH2菌株中表达量下降3-5倍，支持丙酮消除
Clostridium acetobutylicum B3 丙酮生成 ctfAB CtfAB（辅酶A转移酶） 催化 在DH2菌株中表达量下降30-1000倍，丙酮通量大幅减少
Clostridium acetobutylicum B3 溶剂生成 adhE1 AdhE1（NADH依赖性醛脱氢酶） 催化 在DH2中下调30-50倍，与丙酮消除相关
Clostridium acetobutylicum B3 溶剂生成 adhE2 AdhE2（双功能NADH依赖性醛-醇脱氢酶） 催化 在DH2中上调3-21倍，替代AdhE1参与醇生产
Clostridium acetobutylicum B3 电子传递 CA_C0303 铁氧还蛋白（Ferredoxin） 转运 下调2.5倍，减少还原力以H2形式流失
Clostridium acetobutylicum B3 电子传递 CA_C3486 黄素氧还蛋白（Flavodoxin） 转运 上调3-7倍，可替代铁氧还蛋白促进还原力保存
Clostridium acetobutylicum B3 丁酰辅酶A合成 CA_C2542-CA_C2544 EtfAB-Fcd（电子传递黄素蛋白-FAD/FMN脱氢酶复合体） 转运 上调11-44倍，可能参与丁酸通量调节，减少丁酸生成
Clostridium acetobutylicum B3 丙酮酸代谢 CA_C2229 丙酮酸-铁氧还蛋白/黄素氧还蛋白氧化还原酶（PfoA） 催化 在溶剂生成期下调，减少丙酮酸转化为乙酰辅酶A的碳流

关键发现

  1. 工程菌DH2中丙酮被消除至<0.3 g/L
  2. H2释放降低78%
  3. 总醇产率提高19%至0.44 g/g葡萄糖，为至今报道的丁醇发酵最高值
  4. 2,3-丁二醇最高产量达7.9 g/L
  5. 总溶剂产量达22.8 g/L
  6. 代谢通量分析显示丙酮通量减少94%，CO2减少8%
  7. 蛋白质组学显示Adc表达降低3-5倍，CtfAB降低30-1000倍，AdhE1下调30-50倍，AdhE2上调3-21倍，电子传递黄素蛋白EtfAB-Fcd上调11-44倍。

研究结论

丙酮形成本质上是由细胞内还原力不足驱动的，而非溶剂生成基因的直接作用；通过NADH补偿模块有效强化还原力供给，可在工业相关条件下彻底消除丙酮并显著提高溶剂产率，为梭菌的氧化还原工程提供了新方向。