Site-directed mutagenesis of the amino acid residues in β-strand III [Val30-Val36] of D-amino acid aminotransferase of Bacillus sp. YM-1
- 作者
- Hyeon-Su Ro, Seung-Pyo Hong, Hwa-Jung Seo, Tohru Yoshimura, Nobuyoshi Esaki, Kenji Soda, Hak-Sung Kim, Moon-Hee Sung
- 单位
- Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 373-1 Kusong-dong, Yusong-gu, Taejon 305-701, South Korea; Microbial Conversion Research Unit, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Yusong-gu, Taejon 305-600, South Korea; Institute for Chemical Research, Kyoto University, Uji, Kyoto 611, Japan
- 杂志
- FEBS Letters（1996）
- DOI
- 10.1016/S0014-5793(96)01222-7
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明Bacillus sp. YM-1中D-氨基酸氨基转移酶β-折叠片III（Val30-Val36）各氨基酸残基在催化中的作用，特别是Glu32和Lys35的功能
研究策略
采用丙氨酸扫描诱变对β-strand III残基进行逐一替换，通过动力学参数和光谱学分析（pH依赖吸收光谱、荧光光谱）评估突变酶活性变化，并对关键残基Glu32进行保守替换（E32D、E32Q）进一步研究其电荷作用
核心内容
该研究通过丙氨酸扫描诱变系统考察了Bacillus sp. YM-1来源的D-氨基酸氨基转移酶β-折叠片III（Val30-Val36）各残基的催化功能。结果显示，Tyr31和Glu32是催化活性的关键残基，二者突变体的kcat分别降至0.5和1.3 s⁻¹，不足野生型（131.2 s⁻¹）的1%。Lys35则主要通过静电作用参与α-酮戊二酸侧链羧基的识别，其突变体对该底物的Km升高至35.6 mM，远超野生型的2.5 mM。对Glu32的保守替换进一步揭示其作用机制：E32Q仅保留约10%活性，而E32D可恢复65%活性，结合pH依赖吸收光谱分析，表明Glu32的负电荷通过稳定Lys145-PLP内部醛亚胺的质子化状态来维持催化构象，其功能类似于天冬氨酸转氨酶中的Tyr70。该工作首次系统阐明了β-strand III中朝向活性位点残基的贡献，为理解D-氨基酸氨基转移酶的底物识别与催化机制提供了分子层面的依据。
创新点
首次系统研究β-strand III中朝向活性位点的残基（Tyr31、Glu32、Val33、Lys35）的催化贡献；发现Glu32通过负电荷稳定Lys145-PLP席夫碱的质子化状态，类似天冬氨酸转氨酶的Tyr70；发现Lys35通过静电相互作用识别α-酮戊二酸的侧链羧基
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus sp. YM-1 | D-氨基酸转氨代谢（D-谷氨酸合成） | D-氨基酸氨基转移酶基因 | D-氨基酸氨基转移酶 (D-AAT) | 催化 | 野生型酶来源，β-strand III由Val30-Val36组成，Tyr31、Glu32、Val33、Lys35朝向活性位点 |
| Escherichia coli XL1 Blue | D-氨基酸转氨代谢 | 野生型D-AAT基因（pTrc99A载体） | 野生型D-AAT | 催化 | 异源表达野生型，kcat=131.2 s^-1，Km(α-酮戊二酸)=2.5 mM，Km(D-丙氨酸)=2.1 mM |
| Escherichia coli XL1 Blue | D-氨基酸转氨代谢 | Y31A突变D-AAT基因 | D-AAT Y31A | 催化 | kcat=0.5 s^-1，Km(α-酮戊二酸)=10.1 mM，活性低于野生型1% |
| Escherichia coli XL1 Blue | D-氨基酸转氨代谢 | E32A突变D-AAT基因 | D-AAT E32A | 催化 | kcat=1.3 s^-1，Km(α-酮戊二酸)=1.8 mM，活性约1% |
| Escherichia coli XL1 Blue | D-氨基酸转氨代谢 | E32Q突变D-AAT基因 | D-AAT E32Q | 催化 | kcat=13.4 s^-1，保留10%活性 |
| Escherichia coli XL1 Blue | D-氨基酸转氨代谢 | E32D突变D-AAT基因 | D-AAT E32D | 催化 | kcat=85.6 s^-1，恢复65%活性 |
| Escherichia coli XL1 Blue | D-氨基酸转氨代谢 | V33A突变D-AAT基因 | D-AAT V33A | 催化 | kcat=145.1 s^-1，Km(α-酮异戊酸)=15.5 mM，较野生型28.8 mM降低，对支链底物亲和力增加 |
| Escherichia coli XL1 Blue | D-氨基酸转氨代谢 | K35A突变D-AAT基因 | D-AAT K35A | 催化 | kcat=84.3 s^-1，Km(α-酮戊二酸)=35.6 mM（野生型2.5 mM），表明Lys35与α-酮戊二酸负电荷静电相互作用 |
关键发现
- 丙氨酸扫描显示Y31A和E32A的kcat分别降至0.5 s^-1和1.3 s^-1，均小于野生型（131.2 s^-1）的1%
- K35A对α-酮戊二酸的Km升至35.6 mM（野生型2.5 mM），而V33A对α-酮异戊酸的Km降至15.5 mM（野生型28.8 mM）
- Glu32替换为Gln保留10%活性（kcat=13.4 s^-1），替换为Asp恢复65%活性（kcat=85.6 s^-1）
- 荧光光谱表明335 nm吸收带对应取代醛亚胺结构，375 nm增加对应非质子化内醛亚胺
- E32A/E32Q在pH 8.5即出现375 nm吸收增加，而野生型需更高pH，说明Glu32负电荷提高席夫碱亚胺氮的pKa。
研究结论
β-strand III中的Tyr31、Glu32和Lys35对D-AAT催化至关重要：Tyr31通过氢键稳定PLP，Glu32通过负电荷稳定Lys145-PLP内部醛亚胺的质子化状态，Lys35与α-酮戊二酸的侧链羧基形成静电相互作用辅助底物结合；Glu32的功能类似于天冬氨酸转氨酶的Tyr70。