高级醇 · 代谢工程文献库

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A cDNA clone for 3-carene synthase from Salvia stenophylla

作者
Dirk J. Hoelscher, David C. Williams, Mark R. Wildung, Rodney Croteau
单位
Institute of Biological Chemistry, Washington State University, PO Box 646340, Pullman, WA 99164-6340, USA
杂志
Phytochemistry（2003）
DOI
10.1016/S0031-9422(02)00674-x
所属领域
代谢工程
关键词
3-Carene synthaseGeranyl diphosphate cyclizationGlandular trichome isolationHomology-based cDNA cloningLamiaceaeMonoterpeneMonoterpene synthaseRecombinant protein expressionSalvia stenophylla
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解决的核心问题

克隆并鉴定来自被子植物鼠尾草属Salvia stenophylla的(+)-3-carene合酶基因，此前尚无被子植物来源的carane型萜烯合酶报道。

研究策略

通过分离S. stenophylla的腺毛分泌细胞构建富集的cDNA文库，利用同源克隆策略（以薄荷柠檬烯合酶基因作为杂交探针）筛选目标cDNA，并在大肠杆菌中异源表达和功能鉴定。

研究路线图

100%
克隆(+)-3-carene合酶基因
构建腺毛cDNA文库
同源克隆筛选（柠檬烯合酶探针）
大肠杆菌异源表达
全长cDNA（597 aa, 69.7 kDa, TpsB）
重组合酶催化GPP→多种单萜（3-carene 73%）
产物与精油单萜组成一致
被子植物首个carane型单萜合酶
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核心内容

该研究从鼠尾草属植物Salvia stenophylla的腺毛分泌细胞中构建富集cDNA文库，以薄荷柠檬烯合酶基因为探针进行同源筛选，首次克隆得到被子植物来源的(+)-3-carene合酶全长cDNA（GenBank AF527416），其编码597个氨基酸、分子量69.7 kDa的前体蛋白，归属TpsB亚家族。将重组酶在大肠杆菌XL1 Blue中异源表达后，体外酶活实验表明该酶以香叶基焦磷酸为底物，依赖Mg2+/Mn2+离子催化生成多种单萜产物，其中(+)-3-carene占73%、(-)-limonene占13%、myrcene占6%、4-carene占4%、β-phellandrene占1%。精油分析显示3-carene含量为22%，且重组酶的产物分布与精油中的单萜组成高度相似，证明单一酶即可催化生成该植物精油中的几乎所有单萜成分。这是被子植物中第一个被克隆的carane型单萜合酶，为理解单萜合酶的催化多样性和植物精油代谢提供了重要依据。

创新点

首次从被子植物中克隆得到(+)-3-carene合酶；建立了一种从S. stenophylla分离腺毛细胞团的方法；证明单一酶可产生精油中多种单萜产物。

研究对象（3）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli XL1 Blue 单萜生物合成（geranyl diphosphate环化） 3-carene synthase (AF527416) (+)-3-carene synthase 催化 重组表达，产物分布：3-carene 73%, limonene 13%, myrcene 6%, 4-carene 4%, β-phellandrene 1%
Salvia stenophylla (peltate glandular trichomes) 单萜生物合成 3-carene synthase 3-carene synthase preprotein (69.7 kDa) 催化 天然产生精油中单萜，包括3-carene 22%, myrcene 6%, limonene 2.5%等
— — limonene synthase from Mentha spicata 4S-limonene synthase 催化 用作同源克隆杂交探针

关键发现

  1. 从S. stenophylla腺毛cDNA文库中分离到编码69.7 kDa前体蛋白（597 aa）的全长cDNA（GenBank AF527416），属TpsB亚家族
  2. 在大肠杆菌XL1 Blue中表达的重组酶依赖Mg2+/Mn2+离子，将geranyl diphosphate转化为(+)-3-carene（73%）、(-)-limonene（13%）、myrcene（6%）、4-carene（4%）和β-phellandrene（1%）
  3. 精油分析显示3-carene含量22%、myrcene 6%、limonene 2.5%、α-phellandrene 1%、4-carene<1%、β-phellandrene微量
  4. 重组酶产物分布与精油单萜组成相似
  5. 文库大小约10^7 pfu，平均插入片段1.6±0.5 kb
  6. 该酶与唇形科柠檬烯合酶序列一致性64-70%。

研究结论

该单一重组酶负责S. stenophylla精油中几乎全部单萜的生成，且为被子植物中第一个被克隆的carane型单萜合酶。