A cDNA clone for β-caryophyllene synthase from Artemisia annua
- 作者
- Yu Cai, Jun-Wei Jia, John Crock, Zhi-Xin Lin, Xiao-Ya Chen, Rodney Croteau
- 单位
- 中国科学院上海植物生理生态研究所植物分子遗传国家重点实验室; 华盛顿州立大学生物化学研究所; 上海交通大学生命科学与生物技术学院
- 杂志
- Phytochemistry（2002）
- DOI
- 10.1016/S0031-9422(02)00265-0
- 所属领域
- 植物次生代谢
- 关键词
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解决的核心问题
从青蒿（Artemisia annua）中克隆并鉴定β-石竹烯合酶基因，解析其酶学特性和表达调控规律。
研究策略
基于已知被子植物倍半萜合酶保守序列设计引物，采用锚定PCR和cDNA文库筛选获得全长cDNA；将基因在大肠杆菌中异源表达，通过标准酶活测定和GC-MS鉴定产物；利用RT-PCR分析不同组织、发育阶段及创伤和真菌elicitor处理下的基因表达。
核心内容
研究从青蒿中克隆并鉴定了编码β-石竹烯合酶的cDNA（QHS1，GenBank登录号AF472361）。该cDNA全长1902 bp，含1644 bp开放阅读框，编码约60.3 kDa的蛋白。基于保守序列设计引物，通过锚定PCR和cDNA文库筛选获得全长基因，并在大肠杆菌中异源表达。重组酶以法尼基二磷酸为底物，生成97%的β-石竹烯和约2%的α-葎草烯，Km约为1.8 μM，kcat为0.04 s⁻¹；Mg²⁺在0.5 mM时饱和，Mn²⁺效率约为Mg²⁺的一半。表达分析显示，该基因在6周龄幼苗的大多数组织中表达，随株龄增加转录水平下降；创伤处理第1天转录达峰值，真菌elicitor处理后第2天达峰值。青蒿嫩叶精油中β-石竹烯约占30%。
创新点
首次从青蒿中克隆了β-石竹烯合酶cDNA；重组酶以法尼基二磷酸为底物主要生成β-石竹烯（占烯烃产物97%）；发现该基因在多数组织中表达且随发育下降，受真菌elicitor显著诱导，而单萜合酶基因则受创伤强烈诱导，暗示两类萜类合酶受独立信号通路调控。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成（FPP→β-石竹烯） | QHS1 (AF472361) | β-caryophyllene synthase | 催化 | 异源表达重组酶，催化法尼基二磷酸环化为β-石竹烯 |
| Artemisia annua (青蒿) | 倍半萜生物合成 | QHS1 | β-caryophyllene synthase | 催化 | 植物内源表达，受真菌elicitor诱导，参与防御 |
| Artemisia annua (青蒿) | 单萜生物合成 | QH5 | (3R)-linalool synthase | 催化 | 创伤诱导表达，与β-石竹烯合酶在elicitor下表达模式相反 |
关键发现
- 克隆的β-石竹烯合酶cDNA（QHS1，AF472361）为1902 bp，含1644 bp开放阅读框，编码60.3 kDa蛋白
- 重组酶以FPP为底物产生97% β-石竹烯和约2% α-葎草烯
- 其Km约为1.8 μM，kcat为0.04 s^-1
- Mg2+在0.5 mM时饱和，Mn2+在0.1 mM时效率仅为Mg2+的一半
- 青蒿嫩叶精油中β-石竹烯占30%、α-葎草烯占2%
- 创伤诱导后第1天β-石竹烯合酶转录水平最高，真菌elicitor处理后第2天达峰值
- 该基因在6周龄幼苗除根外的多数组织中表达，随株龄增加转录水平下降。
研究结论
青蒿β-石竹烯合酶是倍半萜合酶家族成员，参与植物防御反应；其基因在发育过程中表达下降，可被创伤和真菌elicitor诱导，并与单萜合酶（如芳樟醇合酶）存在差异调控，表明青蒿依赖萜类防御且不同萜类合酶受独立信号途径调节。