Cloning and expression of cDNAs encoding two enzymes of the MEP pathway in Catharanthus roseus

作者: Bertrand Veau, Martine Courtois, Audrey Oudin, Jean-Claude Chenieux, Marc Rideau, Marc Clastre
单位: Laboratoire de Biologie Moléculaire et Biochimie végétale, EA2106, Faculté de Pharmacie, Université de Tours, 31 avenue Monge, 37200 Tours, France
杂志: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression（2000）
DOI: 10.1016/S0167-4781(00)00240-2
所属领域: 代谢工程
关键词: 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase2C-Methyl-d-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase2C-Methyl-d-erythritol 4-phosphate pathwayCatharanthus roseusMonoterpenoid indole alkaloid
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解决的核心问题

克隆长春花（Catharanthus roseus）MEP途径中两个关键酶（DXP还原异构酶和MEC合酶）的cDNA，并探究该途径在单萜吲哚生物碱（MIA）生物合成中的调控作用。

研究策略

基于简并寡核苷酸的RT-PCR策略克隆cDNA，通过序列分析鉴定基因，并利用Northern blot分析不同培养条件下相关基因表达与生物碱积累的相关性。

研究路线图

100%

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核心内容

该研究以长春花细胞培养物为材料，通过简并寡核苷酸介导的RT-PCR策略克隆了MEP途径两个关键酶的cDNA：编码474个氨基酸的DXP还原异构酶（crdxr）和编码236个氨基酸的MEC合酶（crmecs），后者为植物中首次报道。序列分析显示crdxr推导蛋白与拟南芥和薄荷相应酶分别有89%和76%的同一性，crmecs则与大肠杆菌MEC合酶及拟南芥未知蛋白分别有48%和90%的同一性。Northern blot分析表明，在含2,4-D的维持培养基中crdxs和crdxr转录本不积累；转至去除2,4-D的产物培养基后第4天开始积累，并与阿玛碱积累呈正相关，而crmecs在两种条件下均有转录但后者丰度显著增加。甲羟戊酸途径关键酶hmgr的表达则无明显变化，且MEP途径特异抑制剂fosmidomycin可完全抑制MIA产生而不影响细胞生长。这些结果从转录水平证明长春花单萜吲哚生物碱生物合成主要通过质体MEP途径，crdxs和crdxr表达可能在该途径的调控中起关键作用。

创新点

['首次报道植物MEC合酶（crmecs）cDNA的克隆', '揭示MEP途径基因（crdxs、crdxr）表达与MIA积累正相关，而甲羟戊酸途径关键酶hmgr表达无明显变化', '为MIA生物合成主要通过MEP途径提供转录水平证据']

研究对象（4）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Catharanthus roseus（长春花）细胞培养物	MEP（非甲羟戊酸）途径	crdxr	1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶（DXP reductoisomerase）	催化	全长cDNA 1740 bp，编码474 aa，定位于质体，含NADPH结合基序
Catharanthus roseus（长春花）细胞培养物	MEP（非甲羟戊酸）途径	crmecs	2C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶（MEC synthase）	催化	首个植物MEC合酶cDNA，全长994 bp，编码236 aa，定位于质体
Catharanthus roseus（长春花）细胞培养物	MEP（非甲羟戊酸）途径	crdxs	1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶（DXP synthase）	催化	本文分析其表达模式，在MIA产生培养基中随培养时间上调
Catharanthus roseus（长春花）细胞培养物	甲羟戊酸（MVA）途径	hmgr	3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG-CoA reductase）	催化	MVA途径关键酶，在两种培养条件下表达无显著差异，提示对MIA积累无转录水平调控

关键发现

['克隆获得crdxr cDNA，全长1740 bp，编码474个氨基酸，计算分子量51 kDa，等电点6.1
其推导蛋白与拟南芥和薄荷DXP还原异构酶分别有89%和76%的序列同一性', '克隆获得crmecs cDNA，全长994 bp，编码236个氨基酸，计算分子量25 kDa，等电点9.0
其推导蛋白与大肠杆菌MEC合酶有48%同一性，与拟南芥未知蛋白（AAF07360）有90%同一性', '在维持培养基（MM，含4.5 μM 2,4-D）中crdxs和crdxr转录本不积累
转移至产物培养基（PM，去除2,4-D）后，crdxs和crdxr转录本从第4天开始积累，且与阿玛碱（amilacine，MIA标志物）积累相关', 'crmecs在MM和PM中均有转录，但去除2,4-D后其丰度显著增加', 'hmgr基因表达在MM和PM条件下无显著差异', '用MEP途径特异性抑制剂fosmidomycin处理积累MIA的细胞可完全抑制MIA产生而不影响细胞生长（初步结果）']

研究结论

长春花单萜吲哚生物碱（MIA）的生物合成主要通过质体MEP途径而非甲羟戊酸途径；crdxs和crdxr基因的表达可能在转录水平对MIA积累起调控作用。