Bioconversion of (R)-(+)-limonene to perillic acid by the yeast Yarrowia lipolytica
- 作者
- Maria Antonieta Ferrara, Débora S. Almeida, Antonio C. Siani, Leonardo Lucchetti, Paulo S.B. Lacerda, André Freitas, Marcelo R.R. Tappin, Elba P.S. Bon
- 单位
- Instituto de Tecnologia em Fármacos, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, Brazil; Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Ilha do Fundão, Rio de Janeiro, RJ, Brazil
- 杂志
- Brazilian Journal of Microbiology（2014）
- DOI
- 10.1590/S1517-83822014005000008
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
筛选能将(R)-(+)-柠檬烯高效氧化为紫苏酸的酵母菌株，并优化生物转化条件以提高紫苏酸产量。
研究策略
从17株酵母中筛选出Yarrowia lipolytica ATCC 18942；通过单因素实验考察pH、温度、碳源、表面活性剂及底物添加方式的影响；利用抑制剂和厌氧实验初步解析氧化酶系。
核心内容
本研究以解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica ATCC 18942为宿主，系统优化了其将(R)-(+)-柠檬烯生物转化为紫苏酸的条件。通过单因素实验考察pH、温度、碳源、表面活性剂及底物添加方式的影响，并结合抑制剂和厌氧实验初步解析氧化酶系。结果表明，紫苏酸是该菌株催化柠檬烯的唯一氧化产物，最佳转化条件为pH 7.1、25℃、48 h，此时紫苏酸产量达564 mg/L。进一步采用0.5%柠檬烯分6次补料策略，产量提升至855 mg/L，较一次性添加提高50%以上。温度升高至28℃和30℃时产量分别降至442和338 mg/L；非缓冲体系中24 h和48 h产量分别降低约20%和30%，提示缓冲液对转化具有保护作用。吐温20和吐温80分别使产量下降22%和8.5%，而Cu²⁺和Ag⁺完全抑制转化反应，暗示细胞色素P450单加氧酶参与催化。该研究为利用安全易培养的解脂耶氏酵母实现柠檬烯选择性氧化为紫苏酸提供了条件优化基础，最高柠檬烯转化率为16.7%，展现出工业应用潜力。
创新点
首次系统优化了Yarrowia lipolytica催化柠檬烯生成紫苏酸的条件；发现紫苏酸为唯一氧化产物，简化下游处理；分步补料使紫苏酸产量提高50%以上；葡萄糖非必需且缓冲液对转化有保护作用。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Yarrowia lipolytica ATCC 18942 | 柠檬烯→紫苏醇→紫苏醛→紫苏酸 | — | P450 monooxygenase | 催化 | 催化柠檬烯末端甲基氧化为紫苏醇，为限速步骤（推测） |
| Yarrowia lipolytica ATCC 18942 | 柠檬烯→紫苏醇→紫苏醛→紫苏酸 | — | alcohol dehydrogenase | 催化 | 催化紫苏醇氧化为紫苏醛 |
| Yarrowia lipolytica ATCC 18942 | 柠檬烯→紫苏醇→紫苏醛→紫苏酸 | — | aldehyde dehydrogenase | 催化 | 催化紫苏醛氧化为紫苏酸 |
| Candida parapsilosis ATCC 22019 | 柠檬烯→紫苏酸 | — | — | 催化 | 筛选出的另一株可转化菌株，但效率低于Y. lipolytica |
| Arxula adeninivorans ATCC 76597 | 柠檬烯→紫苏酸 | — | — | 催化 | 转化效率低 |
关键发现
- 最佳条件下（pH 7.1、25℃、48 h）紫苏酸产量为564 mg/L
- 分步添加柠檬烯（0.5%分6次）产量达855 mg/L，较一次性添加提高50%以上
- 温度25/28/30℃时产量分别为564/442/338 mg/L
- 非缓冲体系中24 h和48 h产量分别降低20%和30%
- 添加吐温20和吐温80使产量分别下降22%和8.5%
- 直接向发酵液添加底物使产量降低25%
- 最高柠檬烯转化率为16.7%
- Cu2+和Ag+完全抑制转化反应。
研究结论
Yarrowia lipolytica ATCC 18942是一种安全、易培养且具有应用潜力的酵母，可将(R)-(+)-柠檬烯选择性氧化为紫苏酸，且紫苏酸为唯一氧化产物；优化条件为pH 7.1、25℃、分步补料，可实现855 mg/L的紫苏酸产量。