Carotenoid hydroxylase from Haematococcus pluvialis: cDNA sequence, regulation and functional complementation
- 作者
- Hartmut Linden
- 单位
- Lehrstuhl für Physiologie und Biochemie der Pflanzen, Universität Konstanz, D-78434 Konstanz, Germany
- 杂志
- Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression（1999）
- DOI
- 10.1016/S0167-4781(99)00088-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
从雨生红球藻中克隆并鉴定参与虾青素生物合成的β-胡萝卜素羟化酶，阐明其功能与表达调控。
研究策略
构建雨生红球藻cDNA文库，以拟南芥β-胡萝卜素羟化酶片段为探针筛选阳性克隆；在大肠杆菌中异源共表达进行功能互补，验证酶的催化活性；通过Northern blot分析诱导条件下基因的转录水平变化。
核心内容
本研究从雨生红球藻cDNA文库中克隆了编码β-胡萝卜素羟化酶的cDNA，其全长1608 bp，开放阅读框自第90位碱基延伸至第969位终止密码子。该酶与拟南芥、辣椒的植物β-胡萝卜素羟化酶氨基酸序列一致性为38%，与原核生物类胡萝卜素羟化酶的一致性为32–34%。通过在大肠杆菌中异源共表达验证功能，证明该酶具有双功能催化活性，既能将β-胡萝卜素羟化为β-隐黄质和玉米黄质，也能羟化角黄素生成虾青素及侧金盏花黄质。Northern blot分析显示，诱导虾青素合成3小时后可检测到羟化酶转录本，6小时后mRNA水平显著增加，与虾青素在6小时出现显著积累的时间吻合。雨生红球藻在不利条件下虾青素积累量可高达干重的3%。该研究首次报道了绿藻β-胡萝卜素羟化酶cDNA序列，证实该酶是虾青素合成途径中的关键酶，其转录水平在诱导条件下上调，直接参与虾青素的积累，为后续通过代谢工程手段提高虾青素产量奠定了分子基础。
创新点
首次报道绿藻雨生红球藻β-胡萝卜素羟化酶的cDNA序列；证明该酶具有双功能催化活性，既能羟化β-胡萝卜素又能羟化角黄素生成虾青素；揭示该酶在虾青素生物合成诱导条件下转录水平显著上调。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌 JM101 | 类胡萝卜素生物合成 | crtE, crtB, crtI, crtY（来自Erwinia uredovora） | — | 催化 | 在E. coli中合成β-胡萝卜素 |
| 大肠杆菌 JM101 | 虾青素生物合成 | bkt（来自H. pluvialis） | β-胡萝卜素酮化酶 | 催化 | 将β-胡萝卜素转化为角黄素 |
| 大肠杆菌 JM101 | 虾青素生物合成 | β-胡萝卜素羟化酶cDNA（H. pluvialis，GenBank AF162276） | β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 既能羟化β-胡萝卜素，也能羟化角黄素生成虾青素 |
| 雨生红球藻 Haematococcus pluvialis | 虾青素生物合成 | β-胡萝卜素羟化酶基因 | β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 诱导条件下mRNA水平显著上调 |
| 拟南芥 Arabidopsis thaliana | 类胡萝卜素生物合成 | β-胡萝卜素羟化酶cDNA片段（碱基121-743） | β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 用作筛选H. pluvialis文库的异源探针 |
关键发现
- 从雨生红球藻中分离的β-胡萝卜素羟化酶cDNA全长1608 bp，包括23 bp poly(A)尾，开放阅读框从第90位碱基延伸到第969位终止密码子
- 该酶与拟南芥和辣椒的植物β-胡萝卜素羟化酶氨基酸序列一致性为38%，与原核生物类胡萝卜素羟化酶一致性为32-34%
- 在大肠杆菌中异源表达后，该酶可将β-胡萝卜素转化为β-隐黄质和玉米黄质，并可将角黄素转化为虾青素（同时产生侧金盏花黄质）
- Northern blot分析显示，诱导虾青素合成3小时后可检测到羟化酶转录本，6小时后mRNA水平显著增加，而虾青素在6小时也出现显著积累
- 雨生红球藻在不利条件下虾青素积累量可高达干重的3%。
研究结论
该β-胡萝卜素羟化酶是雨生红球藻虾青素生物合成中的关键酶，能够催化β-胡萝卜素和角黄素的羟化反应，其表达在诱导条件下上调，从而参与虾青素的积累。