Engineering of a proteolytically stable human β2-adrenergic receptor/maltose-binding protein fusion and production of the chimeric protein in Escherichia coli and baculovirus-infected insect cells
- 作者
- Wolfgang Hampe, Ralf-Holger Voss, Winfried Haase, Fritz Boege, Hartmut Michel, Helmut Reiländer
- 单位
- Abteilung für Molekulare Membranbiologie, Max-Planck-Institut für Biophysik, Heinrich-Hoffmann-Str. 7, D-60528 Frankfurt/M., Germany; Abteilung für Strukturbiologie, Max-Planck-Institut für Biophysik, Heinrich-Hoffmann-Str. 7, D-60528 Frankfurt/M., Germany; Medizinische Poliklinik der Universität, Klinikstr. 6-8, D-97070 Würzburg, Germany
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2000）
- DOI
- 10.1016/S0168-1656(99)00216-3
- 所属领域
- 蛋白质工程
- 关键词
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解决的核心问题
人类β2-肾上腺素受体是一种高度疏水的G蛋白偶联受体，难以异源表达、纯化和结晶。需要设计一种蛋白水解稳定的融合蛋白，以便在细菌和昆虫细胞中高效生产并纯化该受体用于功能与结构研究。
研究策略
将人β2-肾上腺素受体与大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MalE)融合，利用大肠杆菌遗传操作简便快速的特性，通过核酸外切酶Bal31随机删除linker区，筛选出对宿主蛋白酶稳定的融合蛋白；随后将优化后的融合蛋白转入杆状病毒/昆虫细胞系统以提高产量，并通过His6标签和MalE双亲和层析进行纯化。
研究路线图
核心内容
针对人β2-肾上腺素受体高度疏水、难以异源表达的问题，该研究将其与大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MalE)融合，并利用核酸外切酶Bal31随机删除linker区，筛选出对宿主蛋白酶稳定的融合蛋白。优化后的嵌合体在E. coli中最高产量约3 pmol/mg粗膜蛋白，经蔗糖密度梯度离心后达6 pmol/mg膜蛋白，配体饱和结合KD为96±9 pM；经Ni2+亲和和交联淀粉双柱纯化后总回收约16%，比活性达147 pmol/mg蛋白。转入杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞后产量提升至17 pmol受体/mg膜蛋白，每个细胞约4.2×10^6结合位点，KD为60±6 pM，并伴随N-糖基化修饰。两种宿主中表达的融合蛋白均能激活Gs蛋白并驱动cAMP产生，与天然受体药理特性一致。该策略证明随机遗传工程化linker可有效获得蛋白酶稳定的膜蛋白融合体，为其他GPCR的异源表达、纯化及后续结构研究提供了通用方案。
创新点
['利用随机Bal31删除策略工程化改造linker区，获得对宿主蛋白酶高度稳定的MalE-β2AR融合蛋白', '将MalE作为亲水性融合伴侣，同时用于亲和纯化和增大亲水表面以利于结晶', '在E. coli和昆虫细胞中均实现了功能性表达，并系统验证了配体结合和G蛋白偶联活性']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli (XL1-Blue, JM83, TG1等) | 麦芽糖转运 | malE | MalE (麦芽糖结合蛋白) | 转运 | 作为亲水性融合伴侣，增加β2AR亲水表面并用于淀粉亲和纯化 |
| Escherichia coli | G蛋白偶联受体信号通路 | ADRB2 | 人β2-肾上腺素受体 | 调控 | 目标疏水膜蛋白，与MalE融合后在大肠杆菌中表达 |
| Spodoptera frugiperda (Sf9) | G蛋白偶联受体信号通路 | ADRB2; malE | MalE-β2ARΔ132His6融合蛋白 | 调控 | 用含prepromelittin信号肽的杆状病毒表达，产量17 pmol/mg膜蛋白 |
| Spodoptera frugiperda (Sf9) | G蛋白信号通路 | Gαs, Gβ1, Gγ2 | 异源三聚体Gs蛋白 | 调控 | 与受体融合蛋白共表达，验证受体介导的G蛋白激活 |
| Spodoptera frugiperda (Sf9) | 蛋白分泌/膜插入 | prepromelittin信号肽编码序列 | prepromelittin信号肽 | 转运 | 代替MalE自身信号肽，促进融合蛋白在昆虫细胞中膜插入和加工 |
关键发现
- ['E. coli中最高产量约3 pmol/mg粗膜蛋白，经蔗糖密度梯度离心后内膜炎性蛋白中达6 pmol/mg膜蛋白', 'E. coli中[3H]CGP-12177饱和结合KD=96±9 pM；竞争结合Ki：alprenolol
- 49±0.05 nM，(-)-isoproterenol
- 5±7.3 nM，(+)-isoproterenol
- 7±1.8 μM', 'E. coli中经Ni2+亲和层析回收约30%，经交联淀粉柱二次纯化回收60%，总回收约16%，纯化后比活性147 pmol/mg蛋白', '昆虫细胞(Sf9)中产量达17 pmol受体/mg膜蛋白，每个细胞约4.2×10^6结合位点；[3H]CGP-12177饱和结合KD=60±6 pM', '昆虫细胞中融合蛋白发生N-糖基化，糖基化分子量差约2-3 kDa；去糖基化后仅见89 kDa条带', '昆虫细胞中融合蛋白可与人Gs蛋白(αsβ1γ2)偶联，激动剂(-)-isoproterenol刺激[35S]GTPγS结合，拮抗剂alprenolol抑制', '昆虫细胞来源融合蛋白经Ni2+-淀粉双亲和层析，淀粉柱回收约10%活性；改用alprenolol亲和柱回收约5%', 'E. coli中表达的融合蛋白在French压裂(90 MPa)下膜制备回收率达95%，功能上可激活Gs蛋白并驱动腺苷酸环化酶产生cAMP']
研究结论
通过随机遗传方法成功工程化了蛋白酶稳定的人β2-肾上腺素受体/MalE融合蛋白，该融合蛋白在大肠杆菌和杆状病毒感染的昆虫细胞中均能功能性表达，具有与天然受体相似的配体结合和G蛋白偶联特性。纯化后的融合蛋白接近均一，可用于生化与药理分析，此策略也为其他膜蛋白的融合表达与纯化提供了通用方案。