Detection of a new enzyme for stereoselective hydrolysis of linalyl acetate using simple plate assays for the characterization of cloned esterases from Burkholderia gladioli
- 作者
- A. Schlacher, T. Stanzer, I. Osprian, M. Mischitz, E. Klingsbichel, K. Faber, H. Schwab
- 单位
- Institute of Biotechnology, Petersgasse 12, TU Arbeitsgruppe Genetik, A-8010 Graz, Austria; Institute of Organic Chemistry, Stemyargasse 16, TU-Graz, A-8010 Graz, Austria
- 杂志
- Journal of Biotechnology（1998）
- DOI
- 10.1016/S0168-1656(98)00042-X
- 所属领域
- 生物催化
- 关键词
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解决的核心问题
开发简单快速的平板检测方法，用于鉴定克隆酯酶的水解活性，特别是对空间位阻的乙酸芳樟酯的对映选择性水解。
研究策略
采用荧光底物（HPTS酯、萘酚酯）和pH指示剂褪色法建立平板检测法，筛选来自Burkholderia gladioli的酯酶基因文库，区分EP6和EP10两种酯酶的底物特异性，并对EP6进行制备规模的手性拆分。
核心内容
本研究开发了基于荧光底物（HPTS酯、萘酚酯）和pH指示剂褪色的平板检测法，用于快速区分来自Burkholderia gladioli的克隆酯酶EP6和EP10的底物特异性。结果显示，EP6对C2至C4萘酚酯活性最高，对C6以上几乎无活性，而EP10对C8萘酚酯有活性；EP10可水解HPTS长链酯（C8至C18），EP6则不能。通过pH-shift检测直接以天然底物验证，发现EP6能水解空间位阻大的乙酸芳樟酯而EP10不能。制备规模水解外消旋乙酸芳樟酯时，在20%转化率下得到(S)-芳樟醇（对映体过量45%）和剩余(R)-乙酸芳樟酯（对映体过量15%），对映体比率E约3。粗酶中EP6蛋白占总蛋白的30%至40%。这一简单平板法有效区分了酯酶的底物特异性，并首次检测到能水解叔醇酯的酯酶活性，尽管EP6选择性较低，但为乙酸芳樟酯的对映选择性生物催化提供了新的候选酶，具有进一步优化潜力。
创新点
首次建立用于区分酯酶底物特异性的简单平板检测法；发现EP6能对位阻大的乙酸芳樟酯进行对映选择性水解，而其他多种脂肪酶/蛋白酶无活性；利用pH-shift检测技术直接检测天然底物的水解。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli HB101 | — | — | 酯酶EP6 | 催化 | 克隆pGSP6Δ0表达，水解乙酸芳樟酯，对映选择性E~3 |
| Escherichia coli HB101 | — | — | 酯酶EP10 | 催化 | 克隆pGSP10BΔ0表达，偏好长链脂肪酸HPTS酯 |
| Burkholderia gladioli | — | — | 酯酶EP6/EP10 | 催化 | 供体菌，基因文库来源 |
关键发现
- EP6对C2-C4萘酚酯活性最高，对C6以上几乎无活性
- EP10对C8萘酚酯有活性
- EP10可水解HPTS长链酯（C8、C12、C16、C18），EP6不能。pH-shift检测表明EP6水解乙酸芳樟酯，EP10不水解。制备规模水解外消旋乙酸芳樟酯，20%转化率时得到(S)-芳樟醇，e.e.为45%，剩余(R)-乙酸芳樟酯e.e.为15%，对映体比率E约3。粗酶中EP6蛋白占总蛋白的30-40%。
研究结论
简单平板检测法能有效区分不同酯酶的底物特异性，并检测到罕见的水解叔醇酯的活性；酯酶EP6可作为乙酸芳樟酯对映选择性水解的生物催化剂，尽管选择性较低，有待进一步优化。