Genetics of isoprenoid biosynthesis in Paracoccus zeaxanthinifaciens
- 作者
- Markus Hümbelin, Ann Thomas, Junying Lin, Juan Li, Jan Jore, Alan Berry
- 单位
- Biotechnology Department, Roche Vitamins AG, CH-4070 Basel, Switzerland; TNO Voeding, Utrechtseweg 48, P.O. Box 360, NL-3700 AJ Zeist, The Netherlands
- 杂志
- Gene（2002）
- DOI
- 10.1016/s0378-1119(02)00877-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆和表征玉米黄质产生菌Paracoccus zeaxanthinifaciens中从乙酰辅酶A到法尼基二磷酸（FPP）生物合成的全部基因，揭示其甲瓦龙酸途径的遗传组织
研究策略
基于已知同源序列设计简并引物进行PCR扩增，构建基因组λ文库筛选阳性克隆，结合基因组测序与序列相似性比对，鉴定甲瓦龙酸途径及相关的类异戊二烯生物合成基因
核心内容
该研究克隆并表征了玉米黄质产生菌Paracoccus zeaxanthinifaciens中从乙酰辅酶A到法尼基二磷酸（FPP）生物合成的全部基因，系统揭示了其甲瓦龙酸途径的遗传组织。研究者基于已知同源序列设计简并引物进行PCR扩增，结合基因组λ文库筛选、基因组测序与序列比对，鉴定出六个甲瓦龙酸途径酶基因（hcs、mvaA、mvk、pmk、mvd、idi）组成一个操纵子，而编码GPP/FPP合酶的ispA基因不与之连锁。该菌的HMG-CoA还原酶属于罕见的I类真核/古菌型，在真细菌中极为少见。研究发现两个乙酰-CoA乙酰转移酶基因atoB和phaA，其中phaA为主要活性贡献者——其中断突变体的乙酰-CoA乙酰转移酶活性仅为亲本株的约10%，且只产生少量玉米黄质。此外还鉴定了ddsA和uppS基因分别编码十异戊二烯二磷酸合酶和十一异戊二烯二磷酸合酶，以及负责玉米黄质合成的crtE-crtB-crtY-crtZ基因簇。这些结果首次证明该菌通过甲瓦龙酸途径合成异戊二烯单元，其操纵子结构在已报道细菌中具有独特性，为代谢工程改造微生物生产商业类异戊二烯化合物奠定了基础。
创新点
首次在革兰氏阴性菌（除Borrelia burgdorferi外）中鉴定出完整的甲瓦龙酸途径基因簇；发现该菌甲瓦龙酸操纵子结构独特；发现其HMG-CoA还原酶属于罕见的I类真核/古菌型；发现两个乙酰-CoA乙酰转移酶基因（atoB和phaA），其中phaA为主要活性贡献者
研究对象（18）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Paracoccus zeaxanthinifaciens | 甲瓦龙酸途径 | atoB | 乙酰-CoA乙酰转移酶 | 催化 | 催化两分子乙酰-CoA缩合为乙酰乙酰-CoA，位于crtE上游165nt |
| Paracoccus zeaxanthinifaciens | 聚羟基烷酸(PHA)合成 | phaA | 乙酰-CoA乙酰转移酶 | 催化 | 与phaB成簇，中断后乙酰-CoA乙酰转移酶活性降至亲本10% |
| Paracoccus zeaxanthinifaciens | 聚羟基烷酸(PHA)合成 | phaB | 乙酰乙酰-CoA还原酶 | 催化 | 催化乙酰乙酰-CoA还原为3-羟基丁酰-CoA |
| Paracoccus zeaxanthinifaciens | 聚羟基烷酸(PHA)合成 | phaC | 聚(3-羟基烷酸)合酶 | 催化 | phaC与phaA/phaB不在同一操纵子 |
| Paracoccus zeaxanthinifaciens | 甲瓦龙酸途径 | hcs | HMG-CoA合酶 | 催化 | 催化乙酰-CoA与乙酰乙酰-CoA缩合为HMG-CoA，与已知真细菌直系同源物一致性>40% |
| Paracoccus zeaxanthinifaciens | 甲瓦龙酸途径 | mvaA | HMG-CoA还原酶 | 催化 | I类HMG-CoA还原酶，在真细菌中罕见 |
| Paracoccus zeaxanthinifaciens | 甲瓦龙酸途径 | mvk | 甲瓦龙酸激酶 | 催化 | 催化甲瓦龙酸磷酸化，N端有37个氨基酸插入 |
| Paracoccus zeaxanthinifaciens | 甲瓦龙酸途径 | pmk | 磷酸甲瓦龙酸激酶 | 催化 | 催化磷酸甲瓦龙酸转变为甲瓦龙酸二磷酸 |
| Paracoccus zeaxanthinifaciens | 甲瓦龙酸途径 | mvd | 甲瓦龙酸二磷酸脱羧酶 | 催化 | 催化甲瓦龙酸二磷酸脱羧形成IPP |
| Paracoccus zeaxanthinifaciens | 甲瓦龙酸途径 | idi | IPP异构酶 | 催化 | 催化IPP异构化为DMAPP |
| Paracoccus zeaxanthinifaciens | 类异戊二烯生物合成 | ispA | GPP/FPP合酶 | 催化 | 催化IPP+DMAPP→GPP和IPP+GPP→FPP，不与类异戊二烯基因连锁 |
| Paracoccus zeaxanthinifaciens | 类胡萝卜素合成 | crtE | 八氢番茄红素合酶（原文表格标注） | 催化 | 原文Table 1标注为催化2 GGGP→八氢番茄红素，但通常crtE编码GGPP合酶 |
| Paracoccus zeaxanthinifaciens | 类胡萝卜素合成 | crtB | 八氢番茄红素脱饱和酶 | 催化 | 催化八氢番茄红素→番茄红素（原文表格） |
| Paracoccus zeaxanthinifaciens | 类胡萝卜素合成 | crtY | 番茄红素环化酶 | 催化 | 催化番茄红素→β-胡萝卜素 |
| Paracoccus zeaxanthinifaciens | 类胡萝卜素合成 | crtZ | β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 催化β-胡萝卜素→玉米黄质 |
| Paracoccus zeaxanthinifaciens | 泛醌(辅酶Q-10)合成 | ddsA | 十异戊二烯二磷酸合酶 | 催化 | 催化7个IPP加到FPP，合成十异戊二烯二磷酸 |
| Paracoccus zeaxanthinifaciens | 细胞壁合成 | uppS | 十一异戊二烯二磷酸合酶 | 催化 | 催化8个IPP加到FPP，合成十一异戊二烯二磷酸 |
| Paracoccus zeaxanthinifaciens | tRNA修饰 | miaA | tRNA异戊烯基转移酶 | 催化 | 催化DMAPP与tRNA的腺苷残基缩合形成i6A37 |
关键发现
- 克隆了编码从乙酰-CoA到FPP所有酶的基因，其中六个甲瓦龙酸途径酶基因（hcs、mvaA、mvk、pmk、mvd、idi）组成一个操纵子
- 编码GPP/FPP合酶的ispA基因不与任何类异戊二烯基因连锁
- 发现两个乙酰-CoA乙酰转移酶基因atoB和phaA，phaA基因中断突变体的乙酰-CoA乙酰转移酶活性仅为亲本株R114的约10%，且只产生少量玉米黄质
- HMG-CoA合酶与已知真细菌直系同源蛋白的氨基酸一致性>40%
- HMG-CoA还原酶属于I类，在真细菌中极为罕见
- ddsA基因编码十异戊二烯二磷酸合酶，催化7个IPP分子添加到FPP
- uppS基因编码十一异戊二烯二磷酸合酶，催化8个IPP分子添加到FPP
- 类胡萝卜素基因簇crtE-crtB-crtY-crtZ负责玉米黄质合成
研究结论
Paracoccus zeaxanthinifaciens通过甲瓦龙酸途径合成异戊二烯单元，其甲瓦龙酸基因操纵子结构在已报道细菌中具有独特性；这些基因的鉴定为通过代谢工程改造微生物生产商业重要的类异戊二烯化合物奠定了基础