Reactivities of organic phase biosensors: 6. Square-wave and differential pulse studies of genetically engineered cytochrome P450cam (CYP101) bioelectrodes in selected solvents
- 作者
- Emmanuel I. Iwuoha, Malcolm R. Smyth
- 单位
- Department of Chemistry, University of Western Cape, Bellville 7535, South Africa; School of Chemical Sciences and Sensor Research Centre, Dublin City University, Dublin 9, Ireland
- 杂志
- Biosensors and Bioelectronics（2002）
- DOI
- 10.1016/S0956-5663(02)00180-x
- 所属领域
- 生物传感器 / 电化学
- 关键词
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解决的核心问题
构建可在有机相中工作的CYP101生物电极，实现酶血红素铁与电极之间的直接电子转移，并研究底物（樟脑、金刚烷）存在下电极的响应特性及氧化还原电位变化规律。
研究策略
将基因工程制备的CYP101与合成脂质DDAB（双十二烷基二甲基溴化铵）囊泡分散液混合，再与BSA和戊二醛交联固定在玻璃碳电极上，制备GC/CYP101/DDAB生物电极；采用循环伏安、Osteryoung型方波伏安和差分脉冲伏安在乙腈和氯仿等有机相中表征其电化学行为。
核心内容
本研究构建了可在有机相中工作的CYP101（细胞色素P450cam）生物电极。将基因工程制备的CYP101与DDAB脂质囊泡混合，经BSA和戊二醛交联固定在玻璃碳电极上，采用循环伏安、方波伏安及差分脉冲伏安在乙腈和氯仿中表征其电化学行为。结果显示，该电极在乙腈中可实现直接可逆电子转移，正式电位E⁰'=-380 mV vs Ag/AgCl（峰分离40 mV），较磷酸盐缓冲液的-260 mV阴极位移120 mV；灵敏度为1.5±0.3 ng Fe³⁺/²⁺/μA。加入3 mM樟脑使体系不可逆性增加，方波伏安阳极峰电位从厌氧无底物的-380 mV移至厌氧底物的-350 mV及有氧底物的-250 mV，正式电位相应为-390、-360、-295 mV，表明底物结合降低了启动单加氧所需电位。差分脉冲伏安进一步显示樟脑和氧气存在时峰值电位发生特征性位移。该生物电极在有机相中可检测樟脑和金刚烷，并可用于氧气存在性判断，为多环芳烃监测和药物代谢监控提供了可行工具。
创新点
['首次在有机相中使用DDAB液晶膜固定CYP101并实现直接可逆电子转移', '结合方波伏安和差分脉冲伏安系统分析了底物结合对CYP101血红素铁氧化还原电位的影响', '展示了有机相生物电极可检测樟脑（乙腈）和金刚烷（氯仿），并可用于氧气的存在性判断']
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| — | 樟脑羟化（CYP101单加氧） | CYP101 | 细胞色素P450cam (CYP101) | 催化 | 基因工程制备的CYP101，催化樟脑5-外羟基化，本研究中固定在DDAB膜中作为生物电极的敏感元件 |
| — | — | — | — | 区室化 | 合成脂质DDAB（双十二烷基二甲基溴化铵）形成囊泡液晶膜，模拟生物膜环境，促进CYP101与电极之间的电子转移 |
关键发现
- CYP101生物电极在乙腈中呈直接可逆电子转移，循环伏安测得正式电位E⁰'= -380 mV vs Ag/AgCl（峰分离40 mV），在磷酸盐缓冲液中E⁰'=-260 mV（ΔE=36 mV），有机相相对水相电位阴极位移120 mV
- 生物传感器灵敏度为1.5±0.3 ng Fe³⁺/²⁺/μA。方波伏安测得正式电位-360±23 mV vs Ag/AgCl，且峰电位与频率无关。加入3 mM樟脑使体系不可逆性增加，方波伏安阳极峰电位从无底物厌氧的-380 mV移至厌氧底物的-350 mV、有氧底物的-250 mV
- 正式电位分别为-390、-360、-295 mV vs Ag/AgCl，表明底物结合降低启动单加氧所需电位。差分脉冲伏安显示厌氧+3mM樟脑时峰值电位-260 mV，有氧无樟脑时为-340 mV，有氧+3mM樟脑时为-290 mV。另有文献提及Y96F突变可将活性提高至100倍（本实验未直接测定）。
研究结论
GC/CYP101/DDAB液晶膜生物电极在有机相中能实现CYP101血红素铁的直接电子转移，乙腈中正式电位约为-380 mV vs Ag/AgCl。底物（樟脑）结合使氧化还原电位向阳极方向移动，降低启动催化所需还原电位，并可用方波伏安和差分脉冲伏安检测底物及氧气的存在。该生物电极可用于有机相中樟脑和金刚烷的检测，并有望用于多环芳烃监测和药物代谢监控。