The non-mevalonate pathway of isoprenoids: genes, enzymes and intermediates
- 作者
- Felix Rohdich, Klaus Kis, Adelbert Bacher, Wolfgang Eisenreich
- 单位
- Lehrstuhl fur Organische Chemie und Biochemie, Technische Universitat Munchen, Lichtenbergstrasse 4, D-85747 Garching, Germany
- 杂志
- Current Opinion in Chemical Biology（2001）
- DOI
- 10.1016/S1367-5931(00)00240-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
长期以来甲羟戊酸途径被认为是异戊二烯生物合成的唯一来源，但近年发现存在一条替代途径。本文综述了该非甲羟戊酸途径的基因、酶和中间体，并讨论了其在不同物种中的分布及药物开发意义。
研究策略
基于稳定同位素标记实验、比较基因组学分析和重组蛋白表达与生化表征，系统鉴定非甲羟戊酸途径的基因簇（dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、lytB、gcpE），并通过NMR等技术解析各步中间体结构。
核心内容
该论文系统综述了异戊二烯生物合成中非甲羟戊酸途径（MEP途径）的基因、酶和中间体。作者整合稳定同位素标记实验、比较基因组学分析以及重组蛋白表达与生化表征，系统鉴定了该途径的基因簇（dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、lytB、gcpE），并通过NMR等技术解析出新中间体结构，包括4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇及其2-磷酸衍生物和2,4-环二磷酸衍生物。酶的动力学表征显示，DXS在辣椒中的Vmax可达500 μmol min⁻¹ mg⁻¹，而IspF在大肠杆菌中仅为4.3 μmol min⁻¹ mg⁻¹，反映出各步催化效率差异显著。关键实验证据表明，lytB基因插入失活对集胞藻致死，而外源异戊烯醇可恢复生长，gcpE缺失突变体在大肠杆菌中条件致死并可被甲羟戊酸拯救，直接证明这两步为途径所必需。该途径广泛存在于多数真细菌、藻类及植物质体中，而人体病原体多数依赖此途径，因此其酶被认为是抗生素和除草剂的理想靶点，如fosmidomycin抑制IspC即展现出杀菌、除草和抗疟活性。该工作的重要意义在于确立了非甲羟戊酸途径在异戊二烯代谢中的核心地位，但同时也指出从2C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸到IPP/DMAPP的后期转化步骤仍属未知。
创新点
首次系统整合了非甲羟戊酸途径中多个新基因（ispD、ispE、ispF等）的克隆与酶学表征，鉴定出4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇及其2-磷酸衍生物、2C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸等新中间体；同时揭示了lytB和gcpE的必需性及物种分布规律。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 非甲羟戊酸途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶 | 催化 | 催化丙酮酸与甘油醛-3-磷酸缩合生成1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸；Vmax约300 μmol min-1 mg-1，需要TPP和Mg2+ |
| Escherichia coli | 非甲羟戊酸途径 | ispC | 2C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸合酶（DXP还原异构酶） | 催化 | 依赖NADPH将1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸转化为2C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸；Vmax为11.8 μmol min-1 mg-1，需Mn2+/Mg2+ |
| Escherichia coli | 非甲羟戊酸途径 | ispD | 4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶 | 催化 | 以CTP为底物，将2C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸转化为4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇；Vmax为23 μmol min-1 mg-1，需Mg2+ |
| Escherichia coli | 非甲羟戊酸途径 | ispE | 4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇激酶 | 催化 | ATP依赖的激酶，磷酸化4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇的C2羟基；Vmax为34 μmol min-1 mg-1；还能以极低速率催化异戊烯基单磷酸磷酸化 |
| Escherichia coli | 非甲羟戊酸途径 | ispF | 2C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶 | 催化 | 将4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇2-磷酸转化为2C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸；Vmax为4.3 μmol min-1 mg-1；也能以低速率生成3,4-环磷酸酯和2-磷酸-3,4-环磷酸酯 |
| Synechocystis sp. | 非甲羟戊酸途径 | lytB | LytB蛋白 | 催化 | 基因插入失活致死，添加异戊烯醇和二甲烯丙醇可恢复生长，推测参与途径后期步骤但具体反应未知 |
| Escherichia coli | 非甲羟戊酸途径 | gcpE | GcpE蛋白 | 催化 | 缺失突变体条件致死，可被外源甲羟戊酸拯救，证明其参与IPP生物合成但催化反应未知 |
| Arabidopsis thaliana | 非甲羟戊酸途径 | ispD | 4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶 | 催化 | 染色体基因含11个内含子，编码质体靶向序列；重组酶Vmax为67 μmol min-1 mg-1，需Mg2+ |
| Plasmodium falciparum | 非甲羟戊酸途径 | ispF | 2C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶 | 催化 | 蛋白N端可能为顶质体靶向序列；重组酶催化与大肠杆菌IspF相同的反应，也能生成2-磷酸-3,4-环磷酸酯 |
关键发现
- 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶（DXS）的Vmax：辣椒500、大肠杆菌300、链霉菌370 μmol min-1 mg-1
- 2C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸合酶（IspC）大肠杆菌Vmax为11.8 μmol min-1 mg-1
- 4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶（IspD）大肠杆菌Vmax为23、拟南芥为67 μmol min-1 mg-1
- 4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇激酶（IspE）大肠杆菌Vmax为34、番茄为33 μmol min-1 mg-1
- 2C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶（IspF）大肠杆菌Vmax为4.3 μmol min-1 mg-1。IspE催化异戊烯基单磷酸生成异戊烯基焦磷酸的速率极低（大肠杆菌178±81 pmol g-1 s-1，薄荷1.43 pmol g-1 s-1），可能无生理意义。植物IspE与微生物IspE同源性约30%，植物间高达74%
- 植物IspF与微生物同源性45%、与原生动物38%，拟南芥与长春花IspF同源性88%。lytB基因插入失活对Synechocystis sp.致死，外源异戊烯醇和二甲烯丙醇可恢复生长
- 大肠杆菌gcpE缺失突变体条件致死，可被外源甲羟戊酸拯救。fosmidomycin抑制IspC，具有杀菌、除草和抗疟活性。
研究结论
非甲羟戊酸途径广泛存在于大多数真细菌、藻类及植物质体中，是异戊二烯生物合成的主要或唯一天然途径；人体病原体多数依赖该途径，因此其酶是抗生素和除草剂的重要靶点。目前从2C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸到IPP/DMAPP的后期转化步骤仍未知。