Structural and Chemical Biology of Terpenoid Cyclases

解决的核心问题

萜类环化酶如何通过多步碳正离子级联反应催化生成超过80,000种结构多样的萜类天然产物，以及这些酶的结构与化学机制如何被解析、调控和工程改造。

研究策略

综合使用X射线晶体学、定点突变、计算化学、序列相似性网络分析、嵌合酶设计和体内外活性测定等方法，系统研究各类萜类环化酶（包括I类、II类、双功能及氧化还原型）的结构-功能关系，并探讨工程改造的应用潜力。

研究路线图

100%

核心内容

萜类环化酶是催化生成逾八万种结构多样萜类天然产物的核心酶系，占《天然产物词典》收录化合物近三分之一。该综述系统整合X射线晶体学、定点突变、计算化学及序列相似性网络分析等手段，深入解析了I类、II类及双功能环化酶的结构-功能关系。研究发现，α、β、γ结构域组合的多样性与进化起源决定了催化模板的差异，三核金属簇与阳离子-π相互作用对稳定碳正离子中间体至关重要。通过活性腔工程，如禽类法尼基焦磷酸合酶F112A/F113S双突变使活性腔加深5.8 Å，成功产生C20–C70异戊二烯产物；对嗜热栖热菌八异戊烯基焦磷酸合酶的改造则获得线性C95异戊二烯，刷新了trans-异戊烯基转移酶的产物链长纪录。此外，金黄色葡萄球菌脱氢鲨烯合酶抑制剂BPH-652（IC50为110 mM）可使细菌对过氧化氢敏感性增加约15倍，小鼠腹腔注射后存活细菌减少98%，为抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌提供了新策略。这些成果证明基于结构的蛋白质工程能有效重编程环化级联反应，生成新型高价值产物，为萜类化合物的理性设计与生物制造奠定了理论基础。

创新点

1. 系统梳理了1997年以来萜类环化酶结构生物学进展，揭示α、β、γ结构域组合的多样性和进化起源；2. 明确三核金属簇和阳离子-π相互作用对碳正离子中间体的稳定作用；3. 证明通过活性腔工程（如残基替换和腔深调节）可重编程环化级联反应，产生高价值替代产物；4. 发现脱氢鲨烯合酶抑制剂可作为抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的新策略。

研究对象（40）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
禽类（avian）	萜类前体合成	—	法尼基焦磷酸合酶（FPP synthase）	催化	第一个获得晶体结构的I类萜类合酶，α折叠，三金属簇激活底物。
大肠杆菌	萜类前体合成	—	法尼基焦磷酸合酶（E. coli FPP synthase）	催化	结构显示DDXXXXD基序和3个Mg2+离子。
人	胆固醇生物合成	—	角鲨烯合酶（squalene synthase）	催化	催化两分子FPP偶联生成前角鲨烯二磷酸，需NADPH还原。
金黄色葡萄球菌	金黄色葡萄球菌黄素合成	crtM	脱氢鲨烯合酶（CrtM）	催化	催化FPP偶联生成前角鲨烯二磷酸，与人体角鲨烯合酶结构同源，是新型抗菌药物靶点。
嗜热栖热菌	异戊二烯代谢	—	八异戊烯基焦磷酸合酶（octaprenyl pyrophosphate synthase）	催化	工程突变后能产生C95线性异戊二烯，为trans-异戊烯基转移酶最长产物。
链霉菌（Streptomyces sp.）	萘特霉素生物合成	nphB	ABBA异戊烯基转移酶NphB	催化	PT-桶状折叠，催化异戊二烯基转移至芳香环。
好氧火球菌	泛醌生物合成	ubiA	ApUbiA异戊烯基转移酶	催化	膜整合蛋白，α折叠，与可溶性I类萜类合酶同源。
深古菌	泛醌生物合成	ubiA	AfUbiA异戊烯基转移酶	催化	2.4Å分辨率结构，揭示三金属簇催化和酪氨酸阳离子-π稳定。
植物/细菌	异戊二烯释放	ispS	异戊二烯合酶	催化	催化DMAPP 1,4-消除生成异戊二烯，全球年排放量约1000亿千克。
药用鼠尾草	单萜生物合成	—	(+)-龙脑基二磷酸合酶	催化	活性位点中的极性基团和溶剂分子通过定向固定避免淬灭碳正离子。
植物（柠檬）	单萜生物合成	—	(-)-柠檬烯合酶	催化	催化GPP环化生成(-)-柠檬烯。
植物	单萜生物合成	—	(+)-柠檬烯合酶	催化	催化GPP环化生成(+)-柠檬烯。
植物	单萜生物合成	—	γ-萜品烯合酶	催化	催化GPP环化生成γ-萜品烯。
植物	单萜生物合成	—	1,8-桉叶素合酶	催化	催化GPP环化生成1,8-桉叶素。
链霉菌	单萜生物合成	—	2-甲基异冰片合酶	催化	催化GPP环化生成2-甲基异冰片。
植物（母菊）	倍半萜生物合成	—	α-红没药醇合酶	催化	催化FPP环化生成α-红没药醇。
冷杉	倍半萜生物合成	—	α-红没药烯合酶	催化	催化FPP环化生成α-红没药烯，αβγ域结构。
链霉菌	倍半萜生物合成	—	表-异唑烯合酶	催化	催化FPP环化生成表-异唑烯。
镰刀菌	倍半萜生物合成	—	单端孢霉烯合酶	催化	催化FPP环化生成单端孢霉烯，I类酶经典代表。
链霉菌	倍半萜生物合成	—	塞林烯合酶	催化	催化FPP环化生成塞林烯。
链霉菌	倍半萜生物合成	—	大根香叶烯-4-醇合酶	催化	催化FPP环化生成大根香叶烯-4-醇。
青霉	倍半萜生物合成	—	马兜铃烯合酶	催化	催化FPP环化生成马兜铃烯。
烟草	倍半萜生物合成	—	表-马兜铃烯合酶	催化	αβ结构域，第一个植物倍半萜合酶结构。
植物	倍半萜生物合成	—	月桂烯合酶（Hedycaryol synthase）	催化	Helix G bend参与碳正离子稳定。
植物（棉花）	倍半萜生物合成	—	(+)-δ-杜松烯合酶	催化	催化FPP环化生成(+)-δ-杜松烯。
链霉菌	倍半萜生物合成	—	五环三萜烯合酶（Pentalenene synthase）	催化	细菌I类萜类合酶原型，α折叠。
链霉菌	二萜生物合成	cotB2	环辛二烯合酶（Cyclooctathenol synthase）	催化	催化GGPP环化生成环辛二烯。
植物	二萜生物合成	—	ent-贝壳杉烯合酶	催化	催化GGPP环化生成ent-贝壳杉烯。
太平洋红豆杉	紫杉醇生物合成	—	紫杉二烯合酶	催化	第一个αβγ结构域的I类萜类合酶，βγ为失活残迹。
植物	二萜生物合成	—	半日花烷相关二萜环化酶（LrdC）	催化	催化GGPP环化。
拟南芥	赤霉素生物合成	—	ent-柯巴基焦磷酸合酶	催化	II类萜类合酶，αβγ结构域，βγ界面为活性中心。
链霉菌	二萜生物合成	ptmT2	ent-柯巴基焦磷酸合酶（PtmT2）	催化	细菌II类二萜合酶晶体结构。
嗜酸热脂环芽孢杆菌	三萜生物合成	—	角鲨烯-藿烯环化酶	催化	II类酶原型，βγ双结构域，催化角鲨烯质子化环化。
人	甾醇生物合成	—	氧化鲨烯环化酶	催化	催化2,3-氧化鲨烯环化生成羊毛甾醇。
巨大芽孢杆菌	倍半萜/C35萜生物合成	—	四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶	催化	催化C35线性底物环化，兼有角鲨烯环化酶活性。
天蓝色链霉菌	土臭素生物合成	cyc2	土臭素合酶	催化	双功能αα结构域，催化环化-断裂反应生成土臭素。
大冷杉	二萜树脂酸生物合成	—	冷杉醇合酶	催化	双功能αβγ结构域，同时具有I类和II类活性位点。
真菌（Fusicoccum amygdali）	壳二孢素生物合成	—	壳二孢素合酶	催化	嵌合二萜合酶，催化GGPP环化生成壳二孢素。
大麻	大麻素生物合成	THCA synthase	Δ1-四氢大麻酚酸合酶	催化	氧化还原酶类萜环化酶，催化CBGA氧化环化生成THCA。
长春花	环烯醚萜生物合成	IS	环烯醚萜合酶	催化	依赖NADPH的还原环化酶，催化10-氧代香叶醛环化。

关键发现

['萜类天然产物超过80,000种，约占《天然产物词典》收录化合物的近三分之一。', '萜类环化酶催化反应中平均超过一半的底物碳原子发生键合和杂化状态变化。', '全球植物每年排放的异戊二烯约1000亿千克，超过了人类活动产生的碳氢化合物总量。', '禽类法尼基焦磷酸合酶F112A/F113S双突变使活性腔加深5.8 Å，产生C20–C70异戊二烯产物
A116W或N114W突变则显著偏向生成香叶基焦磷酸（GPP）。', '嗜热栖热菌八异戊烯基焦磷酸合酶经工程改造可生成线性C95异戊二烯，是trans-异戊烯基转移酶最长的产物。', '对超过5000种推定trans-异戊烯基转移酶的计算预测显示，功能预测准确率为62%，在±1个C5单元内准确率为94%。', '金黄色葡萄球菌脱氢鲨烯合酶抑制剂BPH-652的IC50为110 mM（原文数据），使细菌对1.5%过氧化氢的敏感性增加约15倍
小鼠腹腔注射BPH-652后存活细菌数减少98%。', '角鲨烯-藿烯环化酶的β和γ结构域间具有23%的氨基酸序列一致性，提示远古基因复制融合事件。', '萜类环化酶结构域架构包括α、αβ、αβγ、βγ和αα等形式，其中α拓扑为I类，βγ拓扑为II类。', '计算模拟显示苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的侧链芳环可通过阳离子-π相互作用稳定碳正离子中间体，苯环与吲哚环的稳定化能已有定量结果。']

研究结论

萜类环化酶通过复杂但可控的碳正离子级联反应生成海量萜类化合物，其结构域多样性和活性位点模板效应是产物多样性的基础；基于结构的蛋白质工程可重编程环化反应生成新型或商业重要产物；对脱氢鲨烯合酶的抑制为抗MRSA感染提供了新策略。