Biocatalytic Routes to Lactone Monomers for Polymer Production
- 作者
- Hanan L. Messiha, Syed T. Ahmed, Vijaykumar Karuppiah, Reynier Suardiaz, Gabriel A. Ascue Avalos, Natalie Fey, Stephen Yeates, Helen S. Toogood, Adrian J. Mulholland, Nigel S. Scrutton
- 单位
- Manchester Synthetic Biology Research Centre for Fine and Specialty Chemicals (SYNBIOCHEM), School of Chemistry, University of Manchester; Centre for Computational Chemistry, School of Chemistry, University of Bristol
- 杂志
- Biochemistry（2018）
- DOI
- 10.1021/acs.biochem.8b00169
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
如何利用Baeyer-Villiger单加氧酶（BVMOs）将单萜类底物高效转化为内酯单体，并通过酶工程控制区域选择性，为可再生聚合物生产提供绿色、半合成的替代路线。
研究策略
选用来自Pseudomonas sp. HI-70的CPDMO和来自Rhodococcus sp. Phi1的CHMO_Phi1作为生物催化剂，通过定点突变（F249A/F280A/F435A）改变CHMO_Phi1的区域选择性；解析WT与突变体晶体结构，结合分子动力学模拟和DFT计算阐明选择性机制；最后使用温和金属有机催化剂[Mg(BHT)2(THF)2]进行内酯单体的开环聚合。
核心内容
本研究构建了一条从单萜类底物到内酯单体及聚合物的半合成路线。作者选用来自Pseudomonas sp. HI-70的CPDMO和来自Rhodococcus sp. Phi1的CHMO_Phi1作为Baeyer-Villiger单加氧酶催化剂，通过定点突变（F249A/F280A/F435A）成功将CHMO_Phi1对(+)-dihydrocarvone的氧化区域选择性从abnormal内酯切换为normal内酯（dihydrocarvide）。在底物5 mM和10 mM时，CPDMO催化(-)-menthone近完全转化，menthide产率分别达91.4%和92.2%。制备规模获得403 mg menthide（47%收率）和211 mg dihydrocarvide（33%收率）。通过解析野生型（2.37 Å）和突变体（2.49 Å）晶体结构，结合分子动力学模拟和DFT计算，阐明了区域选择性的结构基础：野生型中eq,eq底物构象迁移能垒（18.8 kcal/mol）低于ax,ax构象（23.7 kcal/mol），而突变体中两者相近，从而允许normal内酯生成。最终使用温和金属有机催化剂[Mg(BHT)2(THF)2]进行开环聚合，获得分子量约6.5 kDa、分散度低于1.22的聚合物。本研究为利用计算辅助设计优化BVMO催化剂、实现非石油基可再生生物塑料合成提供了可行路径。
创新点
首次将CHMO_Phi1的三位点突变（F249A/F280A/F435A）用于切换(+)-dihydrocarvone氧化产物从abnormal内酯到normal内酯（dihydrocarvide）；解析了WT和突变体CHMO_Phi1的晶体结构（PDB 6ER9/6ERA），并结合MD和DFT解释了区域选择性的结构基础；采用温和金属有机催化剂实现了生物来源内酯的开环聚合，获得与化学合成单体相当的聚合物。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli BL21(DE3) | 单萜内酯合成（Baeyer-Villiger氧化） | cpdmo | 环十五酮单加氧酶 (CPDMO) | 催化 | 来自Pseudomonas sp. HI-70，催化(-)-menthone生成menthide |
| E. coli C41(DE3) | 单萜内酯合成（Baeyer-Villiger氧化） | chmo_Phi1 | 环己酮单加氧酶 (CHMO_Phi1) | 催化 | 来自Rhodococcus sp. Phi1，野生型催化(+)-dihydrocarvone生成abnormal内酯 |
| E. coli C41(DE3) | 单萜内酯合成（Baeyer-Villiger氧化） | chmo_Phi1 (F249A/F280A/F435A) | 环己酮单加氧酶突变体 (CHMO_Phi1 variant) | 催化 | 三位点突变后区域选择性切换为生成normal内酯dihydrocarvide |
| E. coli BL21(DE3) | 辅因子再生 | ptxD (18-ptxD) | 亚磷酸脱氢酶 (PTDH) | 能量供给 | 来自Pseudomonas stutzeri，融合至BVMO N端，利用亚磷酸钠再生NADPH |
| 体外反应体系 | 辅因子再生 | gdh | 葡萄糖脱氢酶 (GDH) | 能量供给 | 来自Pseudomonas sp.，在葡萄糖/NADP+系统中用于NADPH再生 |
关键发现
- CPDMO催化5 mM (-)-menthone时近完全转化，menthide产率91.4%
- 10 mM时产率92.2%，但底物浓度升至25 mM和50 mM时转化率分别降至61.8%和40.5%。制备规模获得403 mg menthide（47%收率）、211 mg dihydrocarvide（33%收率）、121.4 mg pulegone lactone（29.4%收率）和190.1 mg abnormal dihydrocarvide（14.4%收率）。CHMO_Phi1突变体成功将产物从abnormal内酯切换为normal内酯（dihydrocarvide）。聚合产物的GPC数据：Polymethide (PM) Mn=6.55 kDa, Mw=7.98 kDa, D=1.22
- Polydihydrocarvide (PDC) Mn=6.11 kDa, Mw=7.42 kDa, D=1.21
- Poly-ε-caprolactone (PCL) Mn=6.58 kDa, Mw=11.73 kDa, D=1.79。WT CHMO_Phi1晶体结构分辨率2.37 Å，突变体2.49 Å。DFT计算表明WT中eq,eq底物构象的迁移能垒为18.8 kcal/mol，而ax,ax为23.7 kcal/mol
- 突变体中两个构象的迁移能垒相近（17.9 vs 19.3 kcal/mol），从而允许生成正常内酯。
研究结论
本文展示了结合BVMO生物催化、酶工程和温和开环聚合的半合成路线，可从非石油基单萜原料制备多种内酯单体及相应聚合物，为可再生生物基塑料的开发提供了新途径，并为未来利用计算辅助设计优化生物催化剂提供了指导。