Steroid 5β-reductase from leaves of Vitis vinifera: molecular cloning, expression and modelling.
- 作者
- Mona Ernst, Jennifer Munkert, Manuela Campa, Mickael Malnoy, Stefan Martens, Frieder Müller-Uri
- 单位
- Chair of Pharmaceutical Biology, Department Biology, Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg; Research and Innovation Centre, Fondazione Edmund Mach (FEM)
- 杂志
- Journal of Agricultural and Food Chemistry（2015）
- DOI
- 10.1021/acs.jafc.5b04261
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
探究无强心苷植物葡萄（Vitis vinifera）中类固醇5β-还原酶的存在与功能，以及该酶在非强心苷代谢路径中的潜在作用。
研究策略
从葡萄叶片克隆P5βR基因，在大肠杆菌中异源表达，通过酶活检测、底物特异性分析、同源建模和RNAi转化拟南芥等策略研究其催化性质和生理功能。
核心内容
从无强心苷植物葡萄（Vitis vinifera）叶片中克隆了类固醇5β-还原酶基因VvP5βR，并在大肠杆菌中实现了异源表达。酶学表征显示，重组VvP5βR还原孕酮的活性为5.8±2.8 μkat/kg蛋白（kcat=0.005 s⁻¹），仅生成5β-孕烷-3,20-二酮，且无法还原β-紫罗兰酮。该酶具有底物杂泛性，还能还原香叶醛/橙花醛生成香茅醛，最适温度40–45°C，最适pH 8.0。同源建模表明VvP5βR与毛地黄P5βR结构高度一致。通过RNAi转化拟南芥，VvP5βR转录水平显著降低，叶片脉纹强度减弱，提示其参与叶片形态建成而非强心苷合成。该工作首次从无强心苷植物中功能鉴定类固醇5β-还原酶，证明其底物谱广泛，可能在葡萄萜类/烯酮还原及葡萄酒风味形成中发挥作用，为植物中此类酶的多样化功能提供了新认识。
创新点
首次从无强心苷植物葡萄中克隆并功能鉴定类固醇5β-还原酶，证明其可还原孕酮及小分子烯酮底物，并通过建模和RNAi分析揭示其在叶片脉纹形成中的潜在作用。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21 | 类固醇还原 | VvP5βR (KR259636.1, JF460012.1) | steroid 5β-reductase | 催化 | 重组蛋白rVvP5βR催化孕酮立体选择性还原为5β-孕烷-3,20-二酮 |
| Vitis vinifera cv. Chardonnay | 萜类/烯酮代谢 | VvP5βR | VvP5βR | 催化 | 在葡萄叶片中检测到酶活性，RNAi抑制后影响叶脉形成 |
| Vitis vinifera cv. Cabarnet Sauvignon | 类固醇还原 | JF460012.1 | P5βR | 催化 | 克隆得到1172 bp cDNA序列 |
| Agrobacterium tumefaciens EHA105 | 植物转化 | VvP5βR RNAi construct (pK7WGIGW2(I)) | 无 | 调控 | 用于介导葡萄胚性愈伤组织的RNAi转化 |
| Digitalis lanata | 强心苷生物合成 | P5βR (AY585867) | progesterone 5β-reductase | 催化 | 作为建模模板，PDB ID 2V6G |
| Arabidopsis thaliana | 强心苷/类固醇还原 | AtP5βR (EF579963, At4g24220) | VEP1/progesterone 5β-reductase | 催化 | 高活性对照，酶活620±6.4 μkat/kg，kcat 0.457 s⁻¹ |
关键发现
- 重组VvP5βR对孕酮的酶活为5.8±2.8 μkat/kg蛋白（kcat:
- 005 s⁻¹），葡萄叶片中活性约3.3±2.8 μkat/kg蛋白（kcat:
- 003 s⁻¹）；仅生成5β-孕烷-3,20-二酮；能够还原香叶醛/橙花醛（柠檬醛）生成香茅醛；不能还原β-紫罗兰酮；最适温度40-45°C，最适pH
- 0；VvP5βR与Digitalis lanata的P5βR模型高度一致；RNAi植株GT13/5中VvP5βR转录水平显著降低，叶片脉纹强度减弱。
研究结论
VvP5βR是一种底物杂泛性酶，可能参与葡萄中多种小分子萜类/烯酮的还原步骤，对葡萄酒风味形成有贡献，且并非强心苷代谢的关键酶。