Enhancement of α,ω-Dicarboxylic Acid Production by the Expression of Xylose Reductase for Refactoring Redox Cofactor Regeneration
- 作者
- Chandran Sathesh-Prabu, Sung Kuk Lee
- 单位
- School of Energy and Chemical Engineering, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST), Ulsan 44919, Republic of Korea
- 杂志
- Journal of Agricultural and Food Chemistry（2018）
- DOI
- 10.1021/acs.jafc.8b00376
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
全细胞催化合成α,ω-二羧酸(DCA)时辅因子再生不足，导致氧化还原不平衡和底物转化效率低。
研究策略
构建可共代谢葡萄糖和木糖的工程大肠杆菌，异源表达ω-氧化途径关键酶，并通过共表达木糖还原酶(XR)再生辅因子、平衡氧化还原，同时联产木糖醇。
核心内容
该研究针对全细胞催化合成α,ω-二羧酸（DCA）过程中辅因子再生不足导致的氧化还原失衡问题，构建了可共代谢葡萄糖和木糖的工程大肠杆菌。通过在菌株中共表达CYP153A-P450还原酶融合蛋白、醇脱氢酶、醛脱氢酶及木糖转运蛋白等ω-氧化途径关键酶，并引入木糖还原酶（XR）实现NAD(P)H再生，同时联产木糖醇以平衡胞内氧化还原状态。结果表明，共表达XR的菌株DCA产量较对照提高180%；仅表达单加氧酶和XR时，以1 g/L C14脂肪酸为底物，十四碳二酸产量达1 g/L，转化率95%，较未共表达XR体系提高3.4倍；十二碳二酸产量较对照提高3.6倍，转化率从19%升至67%。此外，以4 g/L木糖为底物时，约95%木糖转化为3.57 g/L木糖醇。该策略通过木糖还原酶依赖的辅因子再生系统，有效解决了CYP450催化中的氧化还原不平衡问题，为脂肪酸基α,ω-二羧酸的绿色合成提供了可行方案。
创新点
['首次利用木糖还原酶增强α,ω-二羧酸生产', '通过XR再生辅因子并平衡氧化还原，同时联产高值化学品木糖醇', '仅表达单加氧酶和XR时即可获得95%底物转化率']
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌MG1655 (GX衍生菌株，如GXER、GXERO等) | 脂肪酸ω-氧化途径 | CYP153A | CYP153A-细胞色素P450还原酶融合蛋白 | 催化 | 来自Marinobacter aquaeolei，催化脂肪酸ω-羟基化 |
| 大肠杆菌MG1655 (GX衍生菌株) | 脂肪酸ω-氧化途径 | CPR | NADPH:细胞色素P450氧化还原酶(CPR)域 | 催化 | 来自Bacillus megaterium CYP102A1，为CYP153A传递电子 |
| 大肠杆菌MG1655 (GX衍生菌株) | 脂肪酸转运 | alkL | AlkL外膜蛋白 | 转运 | 来自Pseudomonas putida，促进疏水性脂肪酸摄取 |
| 大肠杆菌MG1655 (GX衍生菌株) | 脂肪酸ω-氧化途径 | ADH | 醇脱氢酶(ADH) | 催化 | 来自Saccharomyces cerevisiae，氧化ω-羟基脂肪酸为醛 |
| 大肠杆菌MG1655 (GX衍生菌株) | 脂肪酸ω-氧化途径 | ALD | 醛脱氢酶(ALD) | 催化 | 来自Candida tropicalis，氧化ω-醛脂肪酸为羧酸 |
| 大肠杆菌MG1655 (GX衍生菌株) | 木糖代谢/辅因子再生 | xyl1 | 木糖还原酶(XR_NADPH) | 催化 | 来自Candida boidinii，NADPH依赖，催化木糖还原为木糖醇并再生NADP+ |
| 大肠杆菌MG1655 (GX衍生菌株) | 木糖代谢/辅因子再生 | xyl1m | 木糖还原酶突变体(XR_NADH) | 催化 | 突变体(Lys27Arg、Ser27Glu、Asn74Gly)，NADH依赖，用于再生NAD+ |
| 大肠杆菌MG1655 (GX衍生菌株) | 脂肪酸β-氧化抑制 | fadE | 酰基辅酶A脱氢酶 | 催化 | 敲除fadE以阻断β-氧化，避免脂肪酸降解 |
| 大肠杆菌MG1655 (GX衍生菌株) | 脂肪酸转运调控 | fadR | FadR转录调控因子 | 调控 | 敲除fadR以解除对脂肪酸转运蛋白fadL/fadD的抑制 |
| 大肠杆菌MG1655 (GX衍生菌株) | 内源醛脱氢酶活性 | puuC | PuuC醛脱氢酶 | 催化 | 敲除puuC以研究其对ω-醛脂肪酸氧化的影响 |
关键发现
- 共表达XR的菌株DCA产量较对照提高180%
- 仅表达单加氧酶和XR时TDDA底物转化率达95%，较对照提高198%
- 工程菌GXER-MXRNADPH以1 g/L C14脂肪酸为底物时TDDA产量达1 g/L，转化率95%，较未共表达XR体系(32%)提高3.4倍
- DDDA产量较对照提高3.6倍，转化率67%(对照19%)
- 以4 g/L木糖为底物同步联产木糖醇3.57 g/L，约95%木糖转化为木糖醇
- 低底物浓度(0.25 g/L C12-FA或0.5 g/L C14-FA)下近乎100%转化。
研究结论
通过引入木糖还原酶依赖的NAD(P)H再生系统，工程菌株实现了以脂肪酸为原料高效合成α,ω-二羧酸并联产木糖醇，为解决CYP450全细胞催化中的氧化还原不平衡提供了有效策略，并具备工业应用潜力。