高级醇 · 代谢工程文献库

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One-Pot Synthesis of Ginsenoside Rh2 and Bioactive Unnatural Ginsenoside by Coupling Promiscuous Glycosyltransferase from Bacillus subtilis 168 to Sucrose Synthase

作者
Longhai Dai, Can Liu, Jiao Li, Caixia Dong, Jiangang Yang, Zhubo Dai, Xueli Zhang, Yuanxia Sun
单位
National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China; Key Laboratory of Urban Agriculture (North) of Ministry of Agriculture, Beijing University of Agriculture, Beijing, China; University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; Tianjin Key Laboratory on Technologies Enabling Development of Clinical Therapeutics and Diagnosis, School of Pharmacy, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
杂志
Journal of Agricultural and Food Chemistry（2018）
DOI
10.1021/acs.jafc.8b00597
所属领域
合成生物学
关键词
UDP-glucose recycleglycosylationmicrobial UDP-glycosyltransferaseprotopanaxadiolsucrose synthaseunnatural ginsenosides
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解决的核心问题

人参皂苷 Rh2 和生物活性非天然人参皂苷的高效合成受限于 UDP-葡萄糖基转移酶需要昂贵糖供体 UDP-葡萄糖，且酵母细胞工厂产量较低，急需开发高效、低成本的体外合成方法。

研究策略

将来自 Bacillus subtilis 168 的杂乱型糖基转移酶 Bs-YjiC 与拟南芥蔗糖合酶 AtSuSy 偶联，构建一锅双酶级联反应，原位再生 UDP-葡萄糖，以廉价蔗糖为糖基供体，PPD 为苷元，合成了天然人参皂苷 Rh2 和非天然 F12，并通过分批补料优化进一步提高产量。

研究路线图

100%
研究问题：Rh2及非天然人参皂苷合成效率低、依赖昂贵糖供体UDPG
策略：UGT-SuSy一锅双酶级联，原位再生UDPG，以蔗糖为糖基供体
关键改造1：Bs-YjiC表达纯化（E.coli中表达量约600mg/L）
关键改造2：AtSuSy蔗糖合酶表达，UDPG再生循环（最多27次）
关键改造3：一锅反应条件优化（分批补料、pH/温度/酶比）
结果：Rh2产量0.20g/L，F12产量3.98g/L，PPD转化率90%
结果：F12对癌细胞的IC50（44.8-58.8μM），优于Rh2和Rg3
结论：Bs-YjiC区域/立体选择性糖基化，UGT-SuSy级联为高效经济的人参皂苷合成方法，具工业潜力
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核心内容

该研究构建了一锅双酶级联反应体系，用于高效合成人参皂苷Rh2及非天然人参皂苷F12。研究者将来自枯草芽孢杆菌168的杂乱型糖基转移酶Bs-YjiC与拟南芥蔗糖合酶AtSuSy偶联，以廉价蔗糖为糖基供体原位再生UDP-葡萄糖，避免直接添加昂贵的UDP-葡萄糖。Bs-YjiC对原人参二醇（PPD）的C3-OH和C12-OH具有区域和立体选择性糖基化活性，分别生成Rh2和非天然F12。在优化条件下，通过分批补料策略，F12产量达到3.98 g/L（5.07 mM），Rh2产量为0.20 g/L，PPD转化率达90%，UDP-葡萄糖再生循环次数最高为27次。活性测试表明，F12对多种人癌细胞系的IC50在44.8至58.8 μM之间，对DMS53细胞的抑制活性显著强于Rh2（IC50 107.5 μM）和Rg3（IC50大于400 μM）。该研究首次将UGT-SuSy级联应用于三萜皂苷生物合成，证明体外酶级联策略可低成本、高效地合成天然与非天然人参皂苷，具有工业应用潜力。

创新点

['首次利用 UGT-SuSy 级联反应体系生物合成三萜皂苷类化合物', '阐明了 Bs-YjiC 对 PPD 的 C3-OH 和 C12-OH 具有区域和立体选择性糖基化活性', '获得了非天然人参皂苷 F12，并证明其对多种人癌细胞系具有显著抑制活性', '通过优化一锅双酶反应条件，实现了 F12 高达 3.98 g/L 的高产率合成']

研究对象（2）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli BL21(DE3) 人参皂苷生物合成 Bs-YjiC Bs-YjiC 催化 来自 Bacillus subtilis 168 的 UDP-糖基转移酶，催化葡萄糖基转移至 PPD 的 C3-OH 和 C12-OH，合成 Rh2 和 F12
Escherichia coli BL21(DE3) 蔗糖代谢 / UDP-葡萄糖再生 AtSuSy AtSuSy 催化 来自 Arabidopsis thaliana 的蔗糖合酶，催化蔗糖和 UDP 生成 UDP-葡萄糖和果糖，实现 UDP-葡萄糖原位再生

关键发现

  1. Bs-YjiC 能催化 PPD 的 C3-OH 和 C12-OH 糖基化，分别生成人参皂苷 Rh2 和非天然 F12；F12 对 Lovo、HepG2、DMS53、SNU719 癌细胞的 IC50 分别为
  2. 2、58.8、55.9、44.8 μM，对 DMS53 的抑制活性显著强于 Rh2 (IC50
  3. 5 μM) 和 Rg3 (IC50 >400 μM)；酶动力学参数为：Bs-YjiC 对 PPD 的 Km=163.00 μM，kcat=1.31 s-1，对 Rh2 的 Km=139.50 μM，kcat=5.68 s-1；Bs-YjiC 在 E. coli 中表达量约 600 mg/L；优化条件下，一锅法合成 F12 产量
  4. 98 g/L（5.07 mM），Rh2 产量
  5. 20 g/L（0.32 mM），PPD 转化率 90%，UDPG 再生循环次数最高达
  6. 0。

研究结论

Bs-YjiC 可区域和立体选择性地将葡萄糖基转移至 PPD 及 PPD 型人参皂苷的游离 C3-OH 和 C12-OH，合成天然与非天然 PPD 型人参皂苷；体外 UGT-SuSy 级联反应是一种高效、经济的人参皂苷生物合成方法，具有工业应用潜力。