Total Biosynthesis of Antiangiogenic Agent (-)-Terpestacin by Artificial Reconstitution of the Biosynthetic Machinery in Aspergillus oryzae
- 作者
- Koji Narita, Atsushi Minami, Taro Ozaki, Chengwei Liu, Motoichiro Kodama, Hideaki Oikawa
- 单位
- Division of Chemistry, Graduate School of Science, Hokkaido University, Sapporo 060-0810, Japan; Faculty of Agriculture, Tottori University, Tottori 680-8553, Japan
- 杂志
- The Journal of Organic Chemistry（2018）
- DOI
- 10.1021/acs.joc.7b03220
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
复杂抗血管生成萜类化合物(-)-terpestacin的化学合成困难，需要通过异源重构生物合成途径实现其全生物合成。
研究策略
从Bipolaris maydis中鉴定出terpestacin生物合成基因簇（tpcA-D），将其导入Aspergillus oryzae NSAR1进行分步异源表达，逐步解析各修饰酶的功能并重构完整生物合成途径。
核心内容
该研究针对抗血管生成萜类化合物(-)-terpestacin化学合成困难的问题，从Bipolaris maydis中鉴定出包含tpcA-D四个基因的生物合成基因簇，并将其导入米曲霉NSAR1中通过分步异源表达重构完整生物合成途径。研究人员首先确认了双功能萜烯合酶TpcA负责环化生成preterpestacin I骨架，随后逐步引入两个细胞色素P450（TpcB和TpcC）及黄素依赖氧化酶TpcD，阐明其顺序催化机制：TpcB催化C24位区域选择性羟基化，TpcC催化A环16,17位顺式二羟基化，TpcD催化邻二醇氧化为α-二酮并经烯醇化生成终产物。四基因转化株AO-tpcABCD成功产生(-)-terpestacin，在以大米为培养基时产量达11 mg/kg。该研究无需保护基和化学氧化步骤即可实现复杂萜类天然产物的完整生物合成，为同类化合物的制备提供了通用且高效的异源重构平台。
创新点
首次在米曲霉中通过人工重构四个生物合成酶基因实现(-)-terpestacin的全生物合成；阐明了双功能萜烯合酶TpcA、两个细胞色素P450（TpcB和TpcC）以及黄素依赖氧化酶TpcD的顺序催化机制；证明了异源重构策略可替代复杂萜类化合物的化学合成。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus oryzae NSAR1 | terpestacin生物合成途径 | tpcA | TpcA (双功能萜烯合酶) | 催化 | 催化FPP和IPP缩合形成GFPP，再环化生成preterpestacin I |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | terpestacin生物合成途径 | tpcB | TpcB (细胞色素P450) | 催化 | 催化C24位区域选择性羟基化，生成preterpestacin II |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | terpestacin生物合成途径 | tpcC | TpcC (细胞色素P450) | 催化 | 催化A环16,17位顺式二羟基化，生成preterpestacin III |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | terpestacin生物合成途径 | tpcD | TpcD (黄素依赖氧化酶) | 催化 | 催化邻二醇两步氧化为α-二酮，经烯醇化生成terpestacin |
关键发现
- 四基因转化株AO-tpcABCD在米曲霉中成功产生(-)-terpestacin，产量为11 mg/kg大米培养基
- 分离并鉴定了中间体preterpestacin II（4，3.2 mg从1 L MPY培养基）、preterpestacin III（6，1.2 mg从1 kg大米培养基）及副产物5（0.9 mg从500 g大米培养基）
- 最终产物terpestacin（1）的产量为2.2 mg从200 g大米培养基。TpcB催化C24位区域选择性羟基化，TpcC催化A环16,17位顺式二羟基化，TpcD催化邻二醇氧化为α-二酮并经烯醇化生成终产物。
研究结论
通过异源重构成功实现了(-)-terpestacin的完整生物合成，验证了从preterpestacin I到terpestacin的氧化修饰途径。该方法学简单高效，无需保护基和化学氧化步骤，为复杂萜类天然产物的制备提供了通用平台。