Metabolic Engineering-Based Rapid Characterization of a Sesquiterpene Cyclase and the Skeletons of Fusariumdiene and Fusagramineol from Fusarium graminearum
- 作者
- Guangkai Bian, Anwei Hou, Yujie Yuan, Ben Hu, Shu Cheng, Ziling Ye, Yingtong Di, Zixin Deng, Tiangang Liu
- 单位
- Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery, Ministry of Education and School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University; J1 Biotech Co., Ltd.; State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences; Hubei Engineering Laboratory for Synthetic Microbiology, Wuhan Institute of Biotechnology
- 杂志
- Organic Letters（2018）
- DOI
- 10.1021/acs.orglett.8b00366
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
功能未知的倍半萜环化酶FgJ03939的快速功能表征，以及其所产生的新型倍半萜骨架（5/7双环和5/6/3三环）的结构鉴定与生物合成机制研究。
研究策略
利用代谢工程在酿酒酵母中构建FPP过表达平台，高表达FgJ03939以获得足量产物；结合体外酶学实验、GC/MS检测、NMR结构解析和同位素标记实验，阐明产物结构和环化机制。
核心内容
本研究从禾谷镰刀菌中鉴定了一个功能未知的倍半萜环化酶基因FgJ03939（命名为FgFS），并在酿酒酵母YZL141中通过共表达截短的HMG-CoA还原酶（tHMG1）和法尼基焦磷酸合酶（ERG20）构建了FPP过表达平台，用于该酶的高效功能表征。经95小时补料分批发酵，总倍半萜产量达到712 mg/L，其中包含8种倍半萜产物，3种为新化合物：具有罕见5/7双环骨架的fusiurumidiene以及含5/6/3三环骨架的epi-fusagramineol和fusagramineol。体外酶学实验表明FgFS能以GPP、FPP和GGPP为底物分别生成单萜、倍半萜和二萜，其中FPP为最适底物，该酶与α-acorenol合酶FfAAS的序列一致性为66%。结合同位素标记实验，研究阐明了FPP经NPP异构化后进行1,6-环化生成新骨架的机制。该工作不仅发现了新的倍半萜骨架，也验证了基于酿酒酵母FPP过表达平台的萜类合酶快速表征策略，可推广至其他来源的倍半萜合酶研究。
创新点
1) 首次发现并鉴定了具有5/7双环和5/6/3三环罕见骨架的倍半萜 fusiurumidiene、epi-fusagramineol 和 fusagramineol；2) 建立了基于酿酒酵母FPP过表达平台的萜类合酶高效功能表征方法；3) 通过同位素标记实验提出了FPP经NPP异构化进行1,6-环化的新机制。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae (YZL141) | 甲羟戊酸途径 (MVA pathway) | tHMG1 | 截短的HMG-CoA还原酶 (tHMG1) | 催化 | 过表达以增强IPP和DMAPP前体供应 |
| Saccharomyces cerevisiae (YZL141) | 类异戊二烯生物合成 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶 (FPP synthase) | 催化 | 过表达以增强FPP供应 |
| Saccharomyces cerevisiae (YZL141) | 倍半萜生物合成 | FgJ03939 (FgFS) | 倍半萜环化酶 FgFS | 催化 | 来源于Fusarium graminearum，催化FPP环化产生新骨架倍半萜 |
关键发现
- 在酿酒酵母YZL141中过表达tHMG1、ERG20和FgJ03939后，经95 h补料分批发酵，总倍半萜产量达到712 mg/L
- FgJ03939与FfAAS（α-acorenol合酶）序列一致性为66%
- 体外实验表明FgJ03939可利用GPP、FPP和GGPP分别产生单萜、倍半萜和二萜，其中FPP为最适底物
- 共检测到8种倍半萜，其中3种为新化合物：fusiurumidiene (1, 5/7双环)、epi-fusagramineol (2, 5/6/3三环)、fusagramineol (3, 5/6/3三环)，其余5种为已知化合物neroilol (4)、(−)-α-acorenol (5)、(E)-β-farnesene (6)、(+)-α-bisabolol (7)、(−)-α-acoradiene (8)
- 同位素标记实验证实了环化机制。
研究结论
FgFS是一种来自禾谷镰刀菌的新倍半萜合酶，能够产生包含罕见5/7和5/6/3环系的新型倍半萜。通过代谢工程平台成功实现了其功能表征，并阐明了FPP经NPP异构化后进行1,6-环化生成新骨架的机制。该策略可推广至其他来源的倍半萜合酶，加速新萜类骨架的发现和工业应用。