Integration of Yeast Episomal/Integrative Plasmid Causes Genotypic and Phenotypic Diversity and Improved Sesquiterpene Production in Metabolically Engineered Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Bingyin Peng, Sarah J. Weintraub, Zeyu Lu, Samuel Evans, Qianyi Shen, Liam McDonnell, Manuel Plan, Thomas Collier, Li Chen Cheah, Lei Ji, Christopher B. Howard, Will Anderson, Matt Trau, Geoff Dumsday, Erin L. Bredeweg, Eric M. Young, Robert Speight, Claudia E. Vickers
- 单位
- ARC Centre of Excellence in Synthetic Biology, Sydney, NSW 2109, Australia; Centre for Agriculture and the Bioeconomy, School of Biology and Environmental Science, Faculty of Science, Queensland University of Technology, Brisbane, QLD 4000, Australia; Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology (AIBN), The University of Queensland, Brisbane, QLD 4072, Australia; Bioinformatics and Computational Biology, Worcester Polytechnic Institute, Worcester, Massachusetts 01609, United States of America; School of Chemistry and Molecular Biosciences (SCMB), The University of Queensland, Brisbane, QLD 4072, Australia; School of Natural Sciences, Macquarie University, Sydney, NSW 2109, Australia; Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Ecology Institute, Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences), Jinan 250103, PR China; CSIRO Manufacturing, Clayton, VIC 3169, Australia; Functional and Systems Biology Group, Environmental Molecular Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, Richland, Washington 99352, United States; Department of Chemical Engineering, Worcester Polytechnic Institute, Worcester, Massachusetts 01609, United States; Advanced Engineering Biology Future Science Platform, Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation (CSIRO), Black Mountain, ACT 2601, Australia
- 杂志
- ACS Synthetic Biology（2023）
- DOI
- 10.1021/acssynbio.3c00363
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在代谢工程酿酒酵母中，生物重复个体间的表型差异（如倍半萜产量高低）的遗传驱动因素不明；本研究旨在通过长读长全基因组测序确定导致高产与低产克隆差异的基因型原因。
研究策略
利用Oxford Nanopore长读长测序对高产和低产克隆进行全基因组组装与比对，发现2μ游离质粒意外整合到染色体；随后通过设计NdeI线性化质粒、荧光报告基因（YFAST/yEGFP）、菌落PCR长度多态性、qPCR拷贝数分析及摇瓶发酵，系统验证整合位点、拷贝数、基因组重排对橙花叔醇和缬草烯产量的影响，并扩展至无2μ序列的整合型质粒及RPL25介导的HapAmp扩增系统。
核心内容
本研究针对代谢工程酿酒酵母中生物重复个体间倍半萜产量显著差异的遗传驱动因素展开探索。通过Oxford Nanopore长读长全基因组测序比较高产与低产克隆，意外发现通常被认为以游离形式存在的2μ附加体型质粒可整合至染色体，其中高产克隆经GAL1启动子重组形成至少三个串联重复拷贝，低产克隆则为GAL2介导的单或双拷贝整合。进一步利用NdeI线性化质粒转化，获得1至12拷贝的整合克隆，最佳克隆产橙花叔醇约3.5 g/L，而环状2μ质粒克隆产量不及单拷贝整合克隆的一半。缬草烯生产中，最佳克隆产约0.96 g/L，并伴随ACS2表达盒缺失的基因组重排。使用无2μ序列的整合型质粒时，最佳克隆产橙花叔醇约2.8 g/L，而单拷贝及ura3位点参考菌株产量显著偏低。质粒稳定性测试显示多拷贝整合克隆在无选择压力下回收率约84%，远高于环状质粒的6%。研究表明质粒整合状态、拷贝数、整合位点及基因组重排共同决定产物合成效率，筛选生物重复克隆可作为优化酵母细胞工厂的有效进化策略，同时警示质粒表达系统在代谢工程应用中需谨慎评估。
创新点
首次揭示通常被认为游离的2μ序列附加体型质粒可整合到酵母染色体，并导致基因型/表型多样性；利用长读长测序结合荧光标记和PCR分型，系统阐明了整合位点、拷贝数与倍半萜产量之间的关系；提出将质粒整合作为增加酵母细胞工厂遗传多样性、优化产物合成效率的通用方法。
研究对象（16）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 葡萄糖抑制调控 | HXK2 | Hxk2p | 调控 | 通过生长素诱导的蛋白降解使其耗竭，以解除葡萄糖阻遏并提高GAL启动子控制的异源基因表达 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | GAL调控回路 | GAL80 | Gal80p | 调控 | 敲除或通过四环素调控抑制其转录，以激活GAL启动子 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | GAL调控回路 | GAL4 | Gal4p | 调控 | GAL启动子的转录激活因子 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 葡萄糖抑制调控 | MIG1 | Mig1p | 调控 | 转录因子，参与葡萄糖阻遏 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 人工泛素-蛋白酶体系统 | TIR1 | Tir1p | 调控 | 生长素受体，用于生长素诱导的蛋白降解系统 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 倍半萜前体合成 | ERG20 | Erg20p | 催化 | 法尼基焦磷酸（FPP）合酶，过表达以增加倍半萜前体供给 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 倍半萜合成 | AcNES1 | AcNes1p | 催化 | Actinidia chinensis 反式橙花叔醇合酶，催化FPP生成橙花叔醇 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 倍半萜合成 | EgVS* | EgVSp | 催化 | Eryngium glaciale 缬草烯合酶突变体（gI533V R336K K325E R306K D176E H196R），催化FPP生成缬草烯 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 甲羟戊酸途径 | HMG2 | Hmg2p | 催化 | HMG-CoA还原酶，引入K6A突变以缓解反馈抑制 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 甲羟戊酸途径 | ERG12 | Erg12p | 催化 | 甲羟戊酸激酶，过表达以增强MVA通量 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 甲羟戊酸途径 | ERG8 | Erg8p | 催化 | 磷酸甲羟戊酸激酶，过表达以增强MVA通量 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 甲羟戊酸途径 | MVD1 | Mvd1p | 催化 | 甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶，过表达以增强MVA通量 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 甲羟戊酸途径 | IDI1 | Idi1p | 催化 | 异戊烯基焦磷酸异构酶，过表达以增强IPP/DMAPP供应 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 乙酰辅酶A合成 | ACS2 | Acs2p | 催化 | 乙酰辅酶A合酶，过表达以增加乙酰辅酶A供给 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 甲羟戊酸途径 | Ef.mvaE | EfMvaE | 催化 | Enterococcus faecalis 双功能乙酰辅酶A乙酰转移酶/HMG-CoA还原酶，过表达以增强MVA通量 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 甲羟戊酸途径 | Ef.mvaS | EfMvaS | 催化 | Enterococcus faecalis HMG-CoA合酶，过表达以增强MVA通量 |
关键发现
生物重复中橙花叔醇产量呈二态性：高产克隆约3.5 g/L，低产克隆约2.5 g/L。全基因组测序发现2μ质粒pJT9RFR整合到染色体，高产克隆通过GAL1启动子重组形成至少三个串联重复拷贝，低产克隆为GAL2启动子介导的单拷贝或双拷贝整合。在NLD128B菌株中，NdeI线性化的pJT9RFRNdeI转化后获得1-12拷贝的整合克隆，最佳克隆B4（3拷贝）产约3.5 g/L橙花叔醇，而环状质粒2μ克隆产量低于单拷贝整合克隆的一半。缬草烯生产中，最佳克隆6和7产约0.96 g/L缬草烯，两者均存在缺失ACS2表达盒的基因组重排。使用HapAmp载体时，橙花叔醇产量约2.5 g/L，缬草烯约0.76 g/L。整合型质粒pIGFP-NES（无2μ序列）转化后，最佳克隆产约2.8 g/L橙花叔醇，而单拷贝整合克隆（GAL1位点）产量≤1 g/L，ura3位点单拷贝参考菌株仅约0.3 g/L（YPD培养基中为1.6 g/L）。质粒稳定性测试显示，2μ环状质粒在无选择压力下约6%细胞可回收，而多拷贝整合克隆约84%、单拷贝整合克隆约93%可回收。
研究结论
2μ游离型质粒和整合型质粒的染色体整合均可产生基因型（拷贝数、整合位点、基因组重排）和表型（生长、产量）多样性；质粒整合状态、亚染色体位置、基因拷贝数、倍半萜合酶表达水平共同决定产物合成效率。筛选生物重复克隆可作为优化酵母细胞工厂的有效进化-选择策略，同时提示在代谢工程中应谨慎对待基于质粒的表达系统，并需进一步弥合基因/基因组与表型之间的知识鸿沟。