Engineering isoprenoid quinone production in yeast
- 作者
- Divjot Kaur, Duhia Alkhder, Christophe Corre, Fabrizio Alberti
- 单位
- School of Life Sciences and Department of Chemistry, University of Warwick; Warwick Medical School, University of Warwick
- 杂志
- ACS Synthetic Biology（2020）
- DOI
- 10.1021/acssynbio.0c00081
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏一个能够同时提供异戊二烯醌（IQ）生物合成所需甲羟戊酸途径和莽草酸途径前体的酵母平台菌株，以支持IQs的过量生产及隐秘生物合成途径的解析。
研究策略
在过表达甲羟戊酸途径的酿酒酵母菌株EPY300基础上，利用MoClo Yeast Toolkit组装多基因载体，引入大肠杆菌莽草酸激酶II基因aroL并过表达转录激活因子GCN4，以增强莽草酸途径；作为概念验证，进一步过表达COQ2基因，并通过HPLC定量比较不同菌株的辅酶Q6产量。
研究路线图
核心内容
该研究在过表达甲羟戊酸途径的酿酒酵母菌株EPY300基础上，利用MoClo Yeast Toolkit组装多基因载体，引入大肠杆菌莽草酸激酶II基因aroL并过表达转录激活因子GCN4，构建了同时激活甲羟戊酸途径和莽草酸途径的平台菌株EPYFA3。作为概念验证，进一步过表达COQ2基因，并通过HPLC定量比较不同菌株的辅酶Q6产量。结果显示，EPYFA3积累辅酶Q6达49.4±6.2 pmol/mg湿重，较对照EPYDA1的23.0±10.3 pmol/mg提高约2.1倍；过表达COQ2且含莽草酸途径过表达的EPYFA7产量为52.4±8.2 pmol/mg，而仅过表达COQ2的EPYFA4为30.1±2.7 pmol/mg。EPYFA3中GCN4表达量较EPY300提高近5倍，ARO1、ARO2、ARO3、ARO4、ARO8、ARO9表达上调3至22倍。该平台使内源辅酶Q6产量提高近3倍，且不影响ERG9的甲硫氨酸抑制调控。该菌株可作为异戊二烯醌及其衍生化合物的异源生产平台，并有助于异戊二烯醌隐秘生物合成途径的解析与重构。
创新点
构建了同时激活甲羟戊酸和莽草酸途径的酵母平台菌株EPYFA3；通过过表达GCN4全局上调莽草酸途径基因ARO1/2/3/4/8/9以及辅因子合成相关基因；该平台使内源辅酶Q6产量提高近3倍。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 甲羟戊酸途径 | tHMGR | 截短的可溶型3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | EPY300中整合两个额外拷贝，用于提高IPP/DMAPP供应 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 甲羟戊酸途径 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 额外拷贝，促进FPP合成 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 甾醇生物合成 | upc2-1 | Upc2转录因子（半显性等位基因） | 调控 | 上调甾醇生物合成相关基因 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 甲羟戊酸途径/甾醇合成 | ERG9 | 角鲨烯合酶 | 催化 | 通过MET3启动子受蛋氨酸抑制，减少甾醇支路分流 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 辅酶Q6生物合成 | COQ2 | 4-羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶 | 催化 | 过表达，经密码子优化去除BsmBI位点（G885A同义替换） |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 莽草酸途径 | aroL | 莽草酸激酶II | 催化 | 来自大肠杆菌，密码子优化后置于pTEf1强启动子下 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 氨基酸生物合成调控/莽草酸途径调控 | GCN4 | 转录激活因子Gcn4p | 调控 | 过表达，置于pTEf2强启动子下，上调ARO基因及辅因子合成基因 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 莽草酸途径 | ARO1 | Aro1p（五功能酶） | 催化 | 被Gcn4p上调，参与莽草酸途径7步反应 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 莽草酸途径 | ARO2 | Aro2p（分支酸合酶） | 催化 | 被Gcn4p上调，催化分支酸合成 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 莽草酸途径 | ARO3 | Aro3p（DAHP合酶） | 催化 | 被Gcn4p上调，催化莽草酸途径第一步 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 莽草酸途径 | ARO4 | Aro4p（DAHP合酶） | 催化 | 被Gcn4p上调，催化莽草酸途径第一步 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 芳香族氨基酸代谢 | ARO8 | 芳香族氨基转移酶I | 催化 | 被Gcn4p上调，催化4-HPP与酪氨酸相互转化 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 芳香族氨基酸代谢 | ARO9 | 芳香族氨基转移酶II | 催化 | 被Gcn4p上调，催化4-HPP与酪氨酸相互转化 |
关键发现
- 菌株EPYFA3积累辅酶Q6达49.4±6.2 pmol/mg湿重（WCW），较对照EPYDA1的23.0±10.3 pmol/mg提高约2.1倍（原文称近3倍）
- 过表达COQ2且含莽草酸途径过表达的EPYFA7为52.4±8.2 pmol/mg，而仅过表达COQ2的EPYFA4为30.1±2.7 pmol/mg。EPYFA3中GCN4表达量较EPY300提高近5倍，ARO1、ARO2、ARO3、ARO4、ARO8、ARO9表达上调3至22倍。最高产量对应70.71±6.44 nM辅酶Q6，仅消耗141.42±12.88 nM蛋氨酸，不影响ERG9的甲硫氨酸抑制调控。生长实验中EPYFA7在平台期OD600比对照EPYDA3高15%（p<0.001）。
研究结论
成功构建了同时过表达甲羟戊酸途径和莽草酸途径的酵母平台菌株EPYFA3，过表达莽草酸途径是提高辅酶Q6产量的主要因素。该菌株可作为异戊二烯醌及其衍生化合物的异源生产平台，并有助于异戊二烯醌隐秘生物合成途径的解析与重构。