Genetically Encoded Forster Resonance Energy Transfer-Based Biosensors Studied on the Single-Molecule Level
- 作者
- Henning Höfig, Julia Otten, Victoria Steffen, Martina Pohl, Arnold J. Boersma, Jörg Fitter
- 单位
- I. Physikalisches Institut (IA), RWTH Aachen; ICS-5: Molecular Biophysics, Forschungszentrum Jülich; IBG-1: Biotechnology, Forschungszentrum Jülich; Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen
- 杂志
- ACS Sensors（2018）
- DOI
- 10.1021/acssensors.8b00143
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
FRET生物传感器的优化常受限于ensemble测量信息量不足，难以理解传感器修饰对FRET变化的影响机制。
研究策略
利用单分子FRET（smFRET）结合脉冲交替激发（PIE），对葡萄糖传感器和拥挤传感器进行单分子水平表征，通过FRET效率直方图分析传感器亚群、供体-only比例和响应机制。
核心内容
本研究采用单分子福斯特共振能量转移（smFRET）结合脉冲交替激发技术，对基于葡萄糖结合蛋白的葡萄糖传感器和基于弹性蛋白样多肽的分子拥挤传感器进行单分子水平系统表征。通过分析FRET效率直方图，识别传感器亚群分布、供体-only比例及响应机制。结果显示，葡萄糖传感器no.2在无葡萄糖时低FRET群体占92%，饱和葡萄糖（125 mM）时高FRET群体升至91%，最大ΔR为0.98，群体转移效率达87%，但所有葡萄糖传感器均存在约30–40%的供体-only比例，显著削弱潜在FRET响应幅度。单分子测量需8–10小时获取数千至数万个bursts。拥挤实验表明，PEG 6000浓度高达20%时，葡萄糖传感器FRET峰值随拥挤增加而移动，而拥挤传感器G18和GE显示单体峰连续位移，揭示葡萄糖结合诱导群体间转移、拥挤诱导峰值位移的不同机制。该工作确立了smFRET直方图特征作为传感器性能指纹的可行性，定量阐明了供体-only比例对动态范围的负面影响，为定向优化传感器提供了明确靶点，并建议结合SAXS和计算建模深入解析构象变化的结构基础。
创新点
首次对FRET生物传感器进行具有合理计数统计的全面单分子研究；识别出smFRET直方图特征作为传感器性能的指纹；量化供体-only比例对传感器性能的负面影响；区分葡萄糖结合与分子拥挤诱导的不同构象响应机制。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | — | — | — | 调控 | 重组表达传感器的宿主 |
| — | — | glc-BP | Glucose-binding protein | 调控 | 葡萄糖传感域，基于Venus flytrap机制 |
| — | — | mTurquoise2 | mTurquoise2 | 调控 | FRET供体荧光蛋白（CFP变体） |
| — | — | Venus | Venus | 调控 | FRET受体荧光蛋白（YFP变体） |
| — | — | mCerulean3 | mCerulean3 | 调控 | 拥挤传感器供体荧光蛋白 |
| — | — | mCitrine | mCitrine | 调控 | 拥挤传感器受体荧光蛋白 |
| — | — | G18 | G18 linker | 调控 | 非结构化连接肽，54个氨基酸，构成拥挤传感器G18的传感元件 |
| — | — | GE | GE linker | 调控 | α-螺旋连接肽，118个残基，构成拥挤传感器GE的传感元件 |
关键发现
- 葡萄糖传感器no.2具有最大响应ΔR=0.98，其无葡萄糖时低FRET群体（E1=0.09）占92%，高FRET群体（E2=0.63）占8%
- 饱和葡萄糖（125mM）时高FRET群体占91%。传感器no.2的ΔEpop=0.536，ΔEavg/ΔEpop=87%。所有葡萄糖传感器的供体-only比例约30-40%，导致潜在FRET变化相应降低。单分子测量需8-10小时获得数千至数万个bursts。在PEG 6000浓度高达20%时，葡萄糖传感器no.2的FRET效率峰值随拥挤增加而移动，而拥挤传感器G18和GE显示单体峰连续位移。
研究结论
单分子FRET方法能够识别限制传感器性能的关键因素（如供体-only比例、群体转移不彻底、ΔEpop小），为传感器优化提供明确方向；葡萄糖结合诱导群体间转移，拥挤诱导群体峰值位移，二者机制不同；建议结合smFRET、SAXS和计算建模进一步揭示结构-功能关系。