Metabolic engineering of Synechocystis sp. PCC 6803 for production of the plant diterpenoid manyol oxide
- 作者
- Elias Englund, Johan Andersen-Ranberg, Rui Miao, Björn Hamberger, Pia Lindberg
- 单位
- Department of Chemistry-Ångström, Uppsala University; Department of Plant and Environmental Sciences, Center for Synthetic Biology bioSYNergy, Faculty of Science, University of Copenhagen
- 杂志
- ACS Synthetic Biology（2015）
- DOI
- 10.1021/acssynbio.5b00070
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
利用蓝藻光合作用以水和二氧化碳为底物，可持续生产高价值植物二萜类化合物佛司可林（forskolin）的前体13R-manyol oxide（13R-MO），避免从植物中提取或化学合成的高成本与低效率。
研究策略
在集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803中染色体整合表达来自植物Coleus forskohlii的二萜合酶基因CfTPS2和CfTPS3，构建稳定生产13R-MO的工程菌株；进一步共表达来自C. forskohlii的MEP途径酶CfDXS和CfGGPPS以增加前体供应；开发了模块化的pEERM系列整合载体，并比较不同启动子、基因组整合位点及光照条件对产量的影响。
核心内容
该研究在集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803中异源表达来自毛喉鞘蕊花的二萜合酶基因CfTPS2和CfTPS3，通过染色体整合构建了稳定生产植物二萜前体13R-manyol oxide（13R-MO）的工程菌株。研究开发了pEERM系列模块化整合载体，比较了不同启动子、基因组整合位点及光照条件对产量的影响。结果显示，所有菌株均只产生唯一的13R-MO立体异构体。在低光条件下，中性位点整合菌株TPS-N产量最高（0.24 mg g^-1 DCW），而共表达MEP途径酶CfDXS可将psbA2位点菌株TPS-P的产量提高4.2倍至0.45 mg g^-1 DCW，共表达CfGGPPS提高2.6倍。高光条件对TPS-P有利（产量增加3倍），但显著抑制TPS-N。色素分析表明TPS-N类胡萝卜素含量低于野生型，而CfDXS共表达可恢复。该研究首次在蓝藻中实现复杂植物二萜前体的立体特异性生产，证明光驱动合成植物二萜的可行性，为后续佛司可林全合成奠定了基础，同时pEERM载体和镍诱导型启动子工具拓展了蓝藻合成生物学工具箱。
创新点
首次在蓝藻中实现复杂植物二萜前体13R-MO的立体特异性生产；开发了pEERM系列标准化整合载体，支持多基因模块化组装；证明镍诱导型nrsB启动子可作为Synechocystis合成生物学工具，并有助于遗传稳定性。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 二萜生物合成途径 | CfTPS2 | CfTPS2 | 催化 | 来自Coleus forskohlii的二萜合酶，与CfTPS3串联催化GGPP生成13R-MO |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 二萜生物合成途径 | CfTPS3 | CfTPS3 | 催化 | 来自C. forskohlii的二萜合酶，与CfTPS2共同催化生成13R-MO |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | MEP途径 | CfDXS | CfDXS | 催化 | 来自C. forskohlii的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶，MEP途径第一步，去除质体转运肽后表达 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | MEP途径/二萜前体合成 | CfGGPPS | CfGGPPS | 催化 | 来自C. forskohlii的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶，催化IPP/DMAPP生成GGPP |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | MEP途径/二萜前体合成 | crtE | CrtE（内源GGPP合酶） | 催化 | Synechocystis内源GGPP合酶，为二萜合酶提供底物GGPP |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 三萜生物合成途径 | sqs | 鲨烯合酶（Sqs） | 催化 | 编码鲨烯合酶，是hopanoid三萜途径第一步；在TPS-S菌株中通过整合被敲除以解除竞争，但未显著提高13R-MO产量 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | MEP途径 | dxs | 内源DXS | 催化 | Synechocystis内源1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶，MEP途径第一步，可能受调控 |
关键发现
- 成功获得稳定表达CfTPS2和CfTPS3的Synechocystis菌株，并检测到唯一的13R-MO异构体（无13S-MO）。在低光（20 μE）条件下，中性位点整合菌株TPS-N产量最高为0.24 mg g^-1 DCW
- psbA2位点菌株TPS-P为0.11 mg g^-1 DCW
- sqs位点菌株TPS-S为0.15 mg g^-1 DCW。在TPS-P背景中共表达CfDXS（TPS-PD）产量提高4.2倍达0.45 mg g^-1 DCW，共表达CfGGPPS提高2.6倍，共表达两者提高3.5倍。高光（100 μE）下TPS-P产量增加3倍，而TPS-N产量降低至原来的1/5.3。过表达CfDXS或CfGGPPS对中性位点和sqs位点菌株未提高产量甚至降低。色素分析表明TPS-N的类胡萝卜素含量显著低于野生型，而CfDXS共表达可增加类胡萝卜素含量。
研究结论
研究表明蓝藻Synechocystis能通过异源表达植物二萜合酶生产结构复杂的二萜前体13R-MO，并通过共表达MEP途径酶提高产量至0.45 mg g^-1 DCW，为光驱动的植物二萜类化合物生产及后续氧化修饰（如佛司可林全合成）奠定了基础。同时，构建的pEERM载体系列和启动子工具拓展了蓝藻合成生物学工具箱。