De Novo Production of Xanthohumol by a Metabolically Engineered Escherichia coli
- 作者
- Daniela Gomes, Joana Santos, Armando Venâncio, Joana L. Rodrigues, Nigel S. Scrutton, Ligia R. Rodrigues
- 单位
- CEB- Centre of Biological Engineering, Universidade do Minho, 4710-057 Braga, Portugal; LABBELS Associate Laboratory, Braga 4710-057, Portugal; Manchester Institute of Biotechnology, The University of Manchester, Manchester M1 7DN, U.K.
- 杂志
- ACS Synthetic Biology（2025）
- DOI
- 10.1021/acssynbio.5c00221
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
在大肠杆菌中实现黄腐酚（xanthohumol）的从头生物合成，解决天然提取困难及此前仅在酿酒酵母中低产量的问题。
研究策略
通过CRISPR-Cas12a将SAM合酶基因metK整合至已工程化DMAPP途径的大肠杆菌M-PAR-121菌株基因组中，筛选11种异戊烯基转移酶（PT）与来自啤酒花的O-甲基转移酶HlOMT1，组合构建完整的黄腐酚生物合成途径，并在96孔板、摇瓶及2 L生物反应器尺度进行优化。
核心内容
本研究首次在大肠杆菌中实现了黄腐酚（xanthohumol）的从头生物合成。针对天然提取困难及酿酒酵母产量低的问题，作者利用CRISPR-Cas12a将SAM合酶基因metK整合至已工程化DMAPP途径的M-PAR-121菌株基因组中，增强SAM供给，并系统筛选11种异戊烯基转移酶与啤酒花来源的O-甲基转移酶HlOMT1的组合，构建完整合成途径。最佳菌株共表达酪氨酸解氨酶、4CL、查尔酮合酶、CdpC3PT及HlOMT1，在2 L生物反应器中产生21.5 μM（7.3 mg/L）desmethylxanthohumol和14.8 μM（5.3 mg/L）黄腐酚，分别为酿酒酵母产量的3.3倍和37.9倍，是大肠杆菌中首次、也是所有宿主中的最高报道值。中间体柚皮素查尔酮在120小时达669.60 mg/L。结果表明增强DMAPP和SAM双前体供给是成功的关键，但异戊烯基化与甲基化步骤仍为限速瓶颈，有待进一步酶工程优化以满足工业化需求。
创新点
首次在大肠杆菌中实现黄腐酚的从头生物合成；通过基因组整合metK提高SAM供给；利用CRISPR-Cas12a进行多基因整合；系统筛选多个PT与OMT组合，获得迄今报道的最高产量。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli M-PAR-121:BIDI:metK | 苯丙烷类代谢/酪氨酸代谢 | FjTAL | 酪氨酸解氨酶（TAL） | 催化 | 来自Flavobacterium johnsoniae，催化酪氨酸脱氨生成对香豆酸 |
| Escherichia coli M-PAR-121:BIDI:metK | 苯丙烷类代谢 | At4CL | 4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL） | 催化 | 来自Arabidopsis thaliana，催化对香豆酸生成对香豆酰辅酶A |
| Escherichia coli M-PAR-121:BIDI:metK | 类黄酮生物合成（查尔酮合成） | CmCHS | 查尔酮合酶（CHS） | 催化 | 来自Cucurbita maxima，催化对香豆酰辅酶A与丙二酰辅酶A缩合生成柚皮素查尔酮 |
| Escherichia coli M-PAR-121:BIDI:metK | 黄腐酚生物合成（异戊烯基化） | CdpC3PT | 异戊烯基转移酶（CdpC3PT） | 催化 | 来自Neosartorya fischeri，利用DMAPP对柚皮素查尔酮进行异戊烯基化生成desmethylxanthohumol |
| Escherichia coli M-PAR-121:BIDI:metK | 黄腐酚生物合成（甲基化） | HlOMT1 | 氧甲基转移酶（OMT1） | 催化 | 来自Humulus lupulus，以SAM为甲基供体催化desmethylxanthohumol甲基化生成xanthohumol |
| Escherichia coli M-PAR-121:BIDI:metK | 异戊二烯代谢（MEP途径） | BIDI | 异戊烯基二磷酸异构酶（IDI） | 催化 | 来自Bacillus licheniformis，催化IPP与DMAPP相互转化，增强DMAPP供给 |
| Escherichia coli M-PAR-121:BIDI:metK | SAM生物合成（甲硫氨酸代谢） | metK | S-腺苷甲硫氨酸合酶（SAM合成酶） | 催化 | 来自Escherichia coli，催化L-甲硫氨酸与ATP生成SAM，提高甲基供体供给 |
关键发现
- 最佳菌株E. coli M-PAR-121:BIDI:metK（整合Bacillus licheniformis的IDI和E. coli的metK）共表达柚皮素查尔酮途径（FjTAL、At4CL、CmCHS）、CdpC3PT（来自Neosartorya fischeri）和HlOMT1，在2 L生物反应器（补加两次10 g/L葡萄糖）中产生21.5 μM（7.3 mg/L）desmethylxanthohumol和14.8 μM（5.3 mg/L）xanthohumol，为大肠杆菌中首次从头生产，也是所有宿主中的最高产量。96孔板筛选中，该菌株产生4.5±0.29 μM desmethylxanthohumol和1.5±0.14 μM xanthohumol
- 摇瓶LB+M9中产生0.06±0.02 μM desmethylxanthohumol和1.5±0.12 μM xanthohumol。柚皮素查尔酮中间体在120 h时产量达669.60 mg/L。相比酿酒酵母的2.2 mg/L desmethylxanthohumol和0.14 mg/L xanthohumol，本研究DMX产量提高3.3倍，XAN产量提高37.9倍。
研究结论
通过增强DMAPP和SAM两种延伸底物的供给，并筛选合适的异戊烯基转移酶和甲基转移酶，成功在大肠杆菌中构建了黄腐酚的从头生物合成途径，获得了迄今最高产量。但异戊烯基化和甲基化步骤仍是限速步骤，需进一步优化酶活和前体供给以满足工业化需求。