Engineering the Autotroph Methanococcus maripaludis for Geraniol Production
- 作者
- Zhe Lyu, Rachit Jain, Peyton Smith, Travis Fetchko, Yajun Yan, William B. Whitman
- 单位
- Department of Microbiology, University of Georgia; College of Engineering, University of Georgia; Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia
- 杂志
- ACS Synthetic Biology（2016）
- DOI
- 10.1021/acssynbio.5b00267
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
开发一种能够从CO2自养合成高价值萜类化合物香叶醇的微生物底盘，并验证自养产甲烷古菌Methanococcus maripaludis作为该底盘的可行性。
研究策略
将来自罗勒(Ocimum basilicum)的香叶醇合酶(GES)基因经过密码子优化后克隆到M. maripaludis表达载体pMEV4中，在H2/CO2或甲酸盐自养条件下重组表达；采用癸烷覆盖的双相培养系统收集挥发性的香叶醇，并考察不同有机碳源和去除嘌呤霉素对产量的影响。
研究路线图
核心内容
本研究将罗勒来源的香叶醇合酶基因经密码子优化后克隆至产甲烷古菌 Methanococcus maripaludis 的表达载体 pMEV4 中，实现该菌株在 H2/CO2 或甲酸盐自养条件下重组表达外源酶。通过癸烷覆盖的双相培养系统收集挥发性产物，并考察有机碳源添加及嘌呤霉素去除对产量的影响。结果显示，重组菌株 S0027 在 H2/CO2 自养条件下香叶醇产量为 2.8 mg/g 干重，甲酸盐自养条件下为 4.0 mg/g 干重；去除嘌呤霉素后甲酸盐自养产量进一步提升至 4.6 mg/g 干重，该值约为烟草悬浮细胞产量的 15 倍，但低于酵母重组菌的 8 mg/g 干重。添加有机碳源使产量降低 2–3 倍，说明自养条件更有利于产物合成。实验还测得癸烷层中香叶醇浓度达 0.3 mg/L，发酵液到癸烷的提取效率为 13.5–16.5%。该工作首次在产甲烷古菌中实现了 CO2 自养合成萜类化合物，证明外源香叶醇合酶能有效将自养碳流导向目标产物，为以 CO2 为原料生产高价值化学品提供了可行底盘，但产量仍需优化以达到工业水平。
创新点
首次在产甲烷古菌中实现CO2自养生产萜类化合物；建立适用于产甲烷菌的双相产物回收系统；构建了基于自养乙酰辅酶A通路的碳流分配模型。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Methanococcus maripaludis | 异戊二烯生物合成途径(甲羟戊酸途径) | — | — | 能量供给 | 工程改造的底盘菌株，利用其自养代谢固定CO2并合成类异戊二烯脂质 |
| — | 甲羟戊酸途径 | GES | 香叶醇合酶(Geraniol synthase) | 催化 | 源自Ocimum basilicum，密码子优化后在M. maripaludis中表达，催化香叶基二磷酸水解为香叶醇 |
| — | 产甲烷代谢 | mtrE | — | 调控 | 其核糖体结合位点(RBS)被用于构建GES的表达模块 |
| — | 自养乙酰辅酶A生物合成途径 | CODH/ACS (MMP0979-0985) | 一氧化碳脱氢酶/乙酰辅酶A合酶 | 催化 | 模型中的关键酶，负责将CO2固定为乙酰辅酶A |
| — | 碳代谢 | AcsA (MMP0148), Acd (MMP0253) | AMP/ADP依赖性乙酰辅酶A合成酶 | 催化 | 涉及乙酸同化与乙酰辅酶A的生成 |
| — | 氨基酸代谢 | Ald (MMP1513) | 丙氨酸脱氢酶 | 催化 | 参与丙氨酸代谢，与异养生长下的碳流分流有关 |
关键发现
- 重组菌株S0027在H2/CO2自养条件下香叶醇产量为2.8 mg/g干重，在甲酸盐自养条件下为4.0 mg/g干重
- 添加有机碳源使产量降低2-3倍
- 去除嘌呤霉素后甲酸盐自养产量增至4.6 mg/g干重。当使用富甲酸盐培养基(含乙酸和丙氨酸)进行两相培养时，S0027在癸烷层中可检测到0.3 mg/L香叶醇。与烟草悬浮细胞相比，S0027的产量（每克干重4.6 mg）是其15倍
- 但与酵母重组菌的8 mg/g干重相比仍有差距。实验中香叶醇从发酵液到癸烷的提取效率为13.5-16.5%。
研究结论
外源香叶醇合酶基因的成功表达使M. maripaludis能够将自养碳流从细胞类异戊二烯合成转向香叶醇生产，验证了基于CO2固定生产高价值化学品的可行性，但需进一步优化以提高产量至酵母水平。